פרוטוקול זה מאפשר קביעת מבנה מוצלחת של תחום איגוד IKK של NEMO, בצורתו הלא מאוגדת. ופרטים על הייצור וההתגבשות שלה. הפרוטוקול, מנצל את הייצוב הזה של האישור המקורי של קטע התחום מחייב IKK של NEMO, באמצעות מתאמי סליל סלילים, המאפשרים התגבשות וקביעת מבנה.
הביולוגיה המבנית של NEMO, כיעד, מספקת יתרון חשוב בהתפתחות מעכבי NEMO לטיפול במחלות דלקתיות ואוטואימוניות וסרטן. פרוטוקול זה עשוי להיות מורחב לקביעת המבנה של קומפלקסים NEMO, עם פפטיד או מעכבי מולקולה קטנה לגילוי תרופות או אופטימיזציה. החלבון refolding וריכוז, במהלך שלב ייצור החלבון, הם היסוד להשגת עמום NEMO טהור.
הגבלת צבירה והבטחת מיסות בתנאי התגבשות. להדגים את הנהלים יהיו תמר ואיימי, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלנו. התחל על ידי הוספת 20 מיליליטר של פתרון מרק נהדר.
ו-20 מיקרוליטרים של 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין. לבקבוק ארלנפייר 125 מיליליטר. ואחריו כמה microliters של מלאי גליצרול התא, מ 80 מעלות צלזיוס אחסון, של תאים מוסמכים BL21DE3.
השתנה עם וקטור. לאחר טלטול תרבות המתנע בן לילה, ב 37 מעלות צלזיוס ו 220 סיבובים לדקה, לדלל את התאים כדי OD600 של 0.1 ו 250 מיליליטר של מרק נהדר. ומוסיפים אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר.
כאשר OD600 של התרבות מגיע 0.8 כדי 1, להוסיף IPTG לתרבות, לריכוז 500 micromolar. ולגדל את התאים במשך ארבע שעות, ב 37 מעלות צלזיוס, עד OD600 מגיע שש עד 10. בסוף הדגירה, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה.
ולהשעות מחדש את גלולה ב40 מיליליטר של חיץ תזה. פצל את התאים המושעים מחדש לשני אליקוטים של 20 עד 25 מיליליטר. ולהשתמש בעיתונות צרפתית כדי להחיל כ 25, 000 ק"ג לאינץ 'מרובע של לחץ על התאים, פעמיים עד שלוש פעמים לכל aliquot, בחדר קר.
לאחר מכן, מוסיפים אוריאה לתא lysates, לריכוז סופי של שמונה טוחנות. ולהדרור את פתרון התא על פלטפורמת נדנדה במשך שעתיים עד 16 שעות, בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, להעביר את lysates לצינורות אולטרה צנטריפוגה, לפחות שלושה רבעים מלאים, לכל צינור.
ואולרטה צנטריפוגה lysates, במשך 45 דקות. תדקיר את העל-טבעיים לצינור חרוט של 50 מיליליטר. ותטען את האוריאה דגירה על טור IMAC, בשלושה מיליליטר לדקה.
כאשר כל העל-טבעי רץ בעמודה, שטף את העמודה עבור 10 כרכים של עמודות, עם מאגר איגוד, בשלושה מיליליטר לדקה. ולבצע אלוט הדרגתי של חלבון NEMO-EEAA מ 10 עד 500 imidazole מילימול, מעל 12 עמודים נפח הדרגתי. איסוף אליקוטים מיליליטר אחד של eluate, לתוך צלחת איסוף שבר.
לאחר ניתוח דף SDS, למשוך את השברים המכילים את חלבון היעד הטהור ולמדוד את ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay, על פי פרוטוקול סטנדרטי. בחר את השברים חמק, המכיל חלבון. כדי לחשוף את תג HIS6 ולהסיר imidazole עודף מהדגימה, להוסיף פרוטאז TEV, ביחס משקל של 1 עד 10, של חלבון מחשוף TEV, לדגימה חלבון היעד.
ולהאריך את הדגימה בן לילה בארבעה ליטרים של טריס 20 מילימולאר. 150 מילימולר נתרן כלורי ושני מילימולרים פתרון DTT. למחרת בבוקר, לטעון את מדגם NEMO-EEAA מחשוף TEV, על עמוד IMAC השני, במיליליטר אחד לדקה.
איסוף הזרימה דרך שברים מיליליטר אחד, בצלחת אוסף שבר קערה 96. לשטוף את הטור עם חמישה כרכים של 20 מילימולר טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי ו 10 מילימולר imidazole פתרון, במיליליטר אחד לדקה. לאחר הכביסה האחרונה, לרחף את TEV ו uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, עם שלושה כרכים טור של 20 מילימולר טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי, 500 מילימולרים imidazole ושני פתרון DTT מילימולרי, לתוך בקבוק 50 מיליליטר.
משוך את הזרימה דרך שברים, המכיל מבנה NEMO-EEAA מחשוף ולרכז את המדגם עם רכז תאים עורר, לחמישה מיליליטר. לאחר דיאליזה לילה כפי שהודגם, לטעון חמישה מיליליטר של המדגם על 16 מילימטר על ידי 60 ס"מ גודל הדרה עמודות כרומטוגרפיה. חוזר לפי הצורך, בהתאם לאמצעי האחסון לדוגמה.
במיליליטר אחד לדקה, וב-2 מילימולרים טריס, 100 מילימולר נתרן כלורי ושני מילימולרים תווי DDT. לאחר משיכת השברים, המתאימים NEMO-EEAA dimeric, לרכז את המדגם במרכז התא עורר, עם משקל מולקולרי לחתוך קרום של שלושה קילודלטון, לריכוז סופי של 113 micromolar. לאחר מכן, aliquot החלבון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס, עד חודש.
להקרנת מטריצה דלילה, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של פתרון מטריצה דליל לכל אחת מ-96 בארות של צלחת התגבשות תא שתי טיפות. לשבת ולשחרר דיפוזיה אדים. ומוסיפים את תוסף החלבון למתקן טיפות רובוטי.
לאחר מכן, השתמשו במגדיר טיפה רובוטי, כדי לוותר על 100 ננוליטר של תות תותר חלבון ב 1.65 מיליגרם למיליליטר, ביחס של אחד לאחד עם פתרון המאגר בירידה אחת, לנפח סופי של 200 ננוליטר. ולהוסיף 66 nanoliters של פתרון חלבון עם 134 nanoliters של פתרון המאגר, לנפח הסופי של 200 nanoliters בירידה 2. לאחר מכן, לאטום מיד את הצלחת עם סרט איטום ברוחב 3 אינץ'.
לאחר מכן, לאחסן את המגשים באחסון תמונה התגבשות, ב 20 מעלות צלזיוס. בדיקת התמונות שנאספו באופן אוטומטי, לנוכחות גבישים, החל יומיים לאחר אחסון הצלחות. עבור ייצור מלאי זרעים, להעביר את הירידה כולה המכילה את הגביש של עניין, לתוך 50 microliters של פתרון מצב התגבשות, בבקבוקון שסופק, מערכת דור הזרעים.
ומערבולת מלאי הזרעים, עם 20 שניות של פעימות ו -10 שניות של מנוחה, במשך שלוש דקות. לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי את מלאי הזרעים, במרווח אחד עד 10, עד אחד עד 10, 000. ולאחסן את הדילולים בארבע מעלות צלזיוס, עד לשימוש נוסף.
יום עד יומיים לפני המשלוח לסנכרון, חותכים את הקלטת מהחלק העליון של הבאר, עם גביש העניין. ולהוסיף 0.5 microliters של פתרון התגבשות המכיל 12%1, שני פרופאן DiO cryoprotectant, ישירות לבא. לנתק בעדינות את הקריסטל עם לולאת קריו.
לולאה הגביש מן הבאר, ולאחסן את הגביש המכיל לולאת קריו דיסקוס שקוע חנקן נוזלי, עד משלוח עבור דיפוזיה רנטגן. לאחר קבלת נתוני ההתרחבות של קרני הרנטגן, עבד את התעצמויות קנה המידה בשרת STAR ו- ISO. באמצעות אינדקס קריסטלוגרפיה רנטגן לחתוך ממוצע, של 1.2 עבור משטח מגבלת דיפרציה עבור הנתונים.
ולהעמיס על פיניקס. כדי לקבוע את המבנה, השתמש במבנה קרני הרנטגן של GCN4 כמודל חיפוש להחלפה מולקולרית, באמצעות MRage בפיניקס. מבנה 4DMD, יוגדר כאנסמבל.
ופתרון MRage ייבנה בהצלחה לחלק המבנה, המתאים למתאם סליל סליל מסוף הקצה של NEMO-EEAA. למודל החיפוש, עבור שתי השרשראות במעומעם. החלבון המובע יתר על המידה מופיע בלהקה, בערך 14 קילודלטון סמן משקל מולקולרי, לפני טיהור עמוד IMAC הראשון.
ומציג להקת מונומר ולהקה עמומה יותר, ב 14 ו 28 קילודלטון, בהתאמה, לאחר האלוטיון הראשון. מחשוף TEV הושלם כמעט, בעקבות האלוטיון, דרך עמודת IMAC השנייה. כמעט כולו כמו עמום, במשקל המולקולרי הצפוי.
כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, מציגה שיא אחד, המתחמק בין 60 ל-65 מיליליטר, המגיבים לעמעום. הקרנה עדינה מייצרת גבישים שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מלאי זרעים לייצור גבישי NEMO-EEAA, לאיסוף נתונים. כאן מוצגים פרופילי דיפוזיה של גבישי NEMO-EEAA.
ניתוח מבני של חלבון NEMO-EEAA, מגלה סליל סליל מקביל הומודימרי לא סדיר, כ 175 אנגסטרום אורך. אזור סליל סליל רגיל, מקיף את רצף מתאם סליל סליל אידיאלי, בסוף הסיום. ושני ההפטאדים הראשונים של הרצף הנכון של NEMO.
סליל סליל רגיל, קיים גם בתחנת C. החל משאריות NEMO 97 ומקיף את מתאם סליל סליל אידיאלי מסוף C. המבנה מאוגד בטא IKK, מציג אישור סליל סליל פתוח יותר, כדי להתאים את ligand.
עם מרווח בין-דהלי גדול יותר ב-1 עד 2.2 אנגסטרום באזור זה. המבנה של ליגנד ב NEMO, מציע יעד חדש עבור העיצוב של מעכבים באמצעות שיטות חישוביות. ולהקרנה החזותית של כיסים מחייבים עם ספריות מולקולות קטנות.
עכשיו יש לנו נתיב להתגבשות של מבנה NEMO מהונדס מורכב עם ליגנדים מולקולה קטנה. כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של סוג חדש של מעכבים.
