Este protocolo facilita a determinação bem-sucedida da estrutura do domínio vinculante IKK do NEMO, em sua forma desvinculada. E detalhes de sua produção e cristalização. O protocolo, aproveita esta estabilização da confirmação nativa do fragmento de domínio de vinculação IKK do NEMO, através de adaptadores de bobinas enroladas, que facilitam a cristalização e a determinação da estrutura.
A biologia estrutural do NEMO, como alvo, proporciona uma importante vantagem no desenvolvimento de inibidores de NEMO para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes e câncer. Este protocolo pode ser estendido à determinação estrutural de complexos NEMO, com inibidores de peptídeos ou pequenas moléculas para descoberta ou otimização de drogas. O remapeamento e concentração de proteínas, durante a fase de produção de proteínas, são fundamentais para a obtenção de um dimer NEMO puro.
Limitar a agregação e garantir a solubilidade em condições de cristalização. Demonstrando os procedimentos estarão Tamar e Amy, estudantes de pós-graduação em nosso laboratório. Comece adicionando 20 mililitros de solução de caldo fantástico.
E 20 microlitres de uma solução de estoque de 100 mililínitos por mililitro de ampicillina. Para um frasco de 125 mililitros Erlenmeyer. Seguido por alguns microliters de estoque de glicerol celular, a partir de 80 graus Celsius de armazenamento, de células competentes BL21DE3.
Transformado com vetor. Depois de agitar a cultura inicial durante a noite, a 37 graus Celsius e 220 rotações por minuto, diluir as células para um OD600 de 0,1 e 250 mililitros de caldo fantástico. E adicione ampicilina a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro.
Quando o OD600 da cultura atingir 0,8 a 1, adicione iPTG à cultura, a uma concentração de 500 micromolares. E crescer as células por quatro horas, a 37 graus Celsius, até que o OD600 atinja de 6 a 10. No final da incubação, sedimente as células por centrifugação.
E suspenda a pelota em 40 mililitros de tampão de lise. Divida as células re-suspensas em duas alíquotas de 20 a 25 mililitros. E use uma prensa francesa para aplicar aproximadamente 25.000 libras por polegada quadrada de pressão nas células, duas a três vezes por alíquota, em uma sala fria.
Em seguida, adicione ureia aos lises celulares, a uma concentração final de oito molares. E incubar a solução celular em uma plataforma de balanço por duas a 16 horas, em temperatura ambiente. Na manhã seguinte, transfira os lises para tubos ultra-centrífugas, para pelo menos três quartos cheios, por tubo.
E ulrta centrifugar os lises, por 45 minutos. Decante os supernantes em um tubo cônico de 50 mililitros. E carregue a supernasa incubada em uma coluna IMAC, a três mililitros por minuto.
Quando todo o supernaspetivo tiver passado pela coluna, lave a coluna por volumes de 10 colunas, com tampão de ligação, a três mililitros por minuto. E realizar a elução gradiente da proteína NEMO-EEEA de 10 a 500 milimidazol, sobre um gradiente de volume de 12 colunas. Coletando uma alíquota mililitro do eluado, em uma placa de coleta de fração.
Após a análise da página da SDS, puxe as frações contendo a proteína alvo pura e meça a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford, de acordo com o protocolo padrão. Selecione as frações iludidas, contendo proteína. Para cortar a etiqueta HIS6 e remover o excesso de imidazol da amostra, adicione protease TEV, em uma razão de peso de um a 10, de proteína tev cortada, à amostra de proteína alvo.
E dilatar a amostra durante a noite em quatro litros de tris mililitros. 150 mililitros de sódio e duas soluçãos de DTT mililitro. Na manhã seguinte, carregue a amostra TEV-EEEA, em uma segunda coluna IMAC, a um mililitro por minuto.
Coletando o fluxo através de uma fração de mililitro, em uma placa de coleta de fração de tigela 96. Lave a coluna com cinco volumes de Tris de 20 mililitros, 150 mililitros de sódio e 10 milimidazol, a um mililitro por minuto. Após a última lavagem, elute o TEV e tios HIS6 NEMO-EEAA, com três volumes de coluna de 20 mililitros Tris, 150 mililitros de sódio, 500 milimilas imidazol e duas soluçãos de DTT mililitro, em um frasco de 50 mililitros.
Puxe o fluxo através de frações, contendo construção NEMO-EEEA rachada e concentre a amostra com um concentrador de células mexidas, para cinco mililitros. Após a diálise durante a noite, como demonstrado, carregue cinco mililitros da amostra em 16 milímetros por colunas de cromatografia de exclusão de tamanho de 60 centímetros. Repetindo conforme necessário, de acordo com o volume da amostra.
A um mililitro por minuto, e a dois Tris mililitros, 100 mililitros de sódio e duas soluçãos de DDT mililitros. Após puxar as frações, correspondentes ao DIMERIC NEMO-EEEA, concentre a amostra no concentrador celular agitado, com um peso molecular cortado membrana de três kilodalton, para uma concentração final de 113 micromolar. Em seguida, alíquotar a proteína para armazenamento a quatro graus Celsius, por até um mês.
Para triagem matricial esparsa, adicione 60 microliters de solução matricial esparsa em cada um dos 96 poços de uma placa de cristalização de câmara de duas gotas. Para sentar e soltar difusão de vapor. E adicione a solução de proteína a um setter robótico.
Em seguida, use um setter robótico, para distribuir 100 nanoliters de solução proteica a 1,65 miligramas por mililitro, em uma proporção de um para um com solução de reservatório em queda um, para um volume final de 200 nanoliters. E adicionar 66 nanoliters de solução proteica com 134 nanoliters de solução de reservatório, a um volume final de 200 nanoliters em queda dois. Em seguida, sele imediatamente a placa com fita de vedação de três polegadas de largura.
Em seguida, armazene as bandejas em um armazenamento de imagens cristalizadores, a 20 graus Celsius. Verificando as imagens coletadas automaticamente, para a presença de cristais, começando dois dias após o armazenamento das placas. Para geração de sementes, transfira toda a gota contendo o cristal de interesse, em 50 microliters de solução de condição de cristalização, no frasco fornecido, a partir de um kit de geração de sementes.
E vórtice o estoque de sementes, com 20 segundos de pulsação e 10 segundos de descanso, por três minutos. Então, diluir em série o estoque de sementes, em um a 10 incrementos, para um a 10.000. E armazene as diluições a quatro graus Celsius, até usar mais.
Um a dois dias antes do embarque para síncrotron, corte a fita do topo do poço, com o cristal de juros. E adicione 0,5 microliters de solução de cristalização contendo 12%um, dois propanos DiO crioprotetor, diretamente ao poço. Desaloja suavemente o cristal com um laço criogeno.
Enrole o cristal do poço, e armazene o cristal contendo loop crio em um disco imerso em nitrogênio líquido, até o envio para difração de raios-X. Depois de receber os dados de difração de raios-X, processe as intensidades dimensionadas no servidor STAR e ISO. Usando uma indexação de cristalografia de raios-X cortada média, de 1,2 para a superfície limite de difração para os dados.
E carregue em Phoenix. Para determinar a estrutura, use a estrutura de raios-X do GCN4 como modelo de busca para substituição molecular, usando MRage em Phoenix. A estrutura 4DMD será definida como um conjunto.
E a solução MRage será construída com sucesso para a parte da estrutura, correspondendo ao adaptador de bobina coiled do terminal final do NEMO-EEEA. para o modelo de pesquisa, para ambas as cadeias no dimer. A proteína sobre expressa aparece em uma banda, com aproximadamente 14 kilodalton marcador de peso molecular, antes da primeira purificação da coluna IMAC.
E exibe uma banda monômera e uma banda mais fraca, aos 14 e 28 kilodaltons, respectivamente, após a primeira eluição. O decote TEV está praticamente completo, seguindo a elução, através da segunda coluna IMAC. Quase inteiramente como um mais escuro, com o peso molecular esperado.
Cromatografia de exclusão de tamanho, exibe um único pico, iludindo entre 60 a 65 mililitros, que estão respondendo ao estonteante. A triagem fina produz cristais que podem ser utilizados para produzir um estoque de sementes para a produção de cristais NEMO-EEEA, para coleta de dados. Aqui, são mostrados os perfis de difração de cristais nemo-EEEA representativos.
A análise estrutural da proteína NEMO-EEEA revela uma bobina paralela irregular homodimerica, aproximadamente 175 angstroms de comprimento. A região regular da bobina enrolada abrange a sequência ideal do adaptador de bobina enrolada, no final do cupinus. E os dois primeiros heptads da sequência adequada nemo.
Uma bobina enrolada regular, também está presente no cupinus C. Começando pelo resíduo NEMO 97 e abrangendo o adaptador ideal de bobina do terminal C. A estrutura beta vinculada do IKK exibe uma confirmação de bobina enrolada mais aberta, para acomodar o ligante.
Com um espaçamento interélico maior por 1 a 2,2 angstroms nesta região. A estrutura de um ligante em NEMO, oferece um novo alvo para o design de inibidores através de métodos computacionais. E para a triagem visual de bolsos de ligação com pequenas bibliotecas de moléculas.
Agora temos um caminho para cristalização da construção de NEMO projetada em complexo com ligantes de moléculas pequenas. Para ajudar no desenvolvimento e otimização de uma nova classe de inibidores.
