يسهل هذا البروتوكول تحديد الهيكل الناجح للمجال الملزم IKK NEMO، في شكله غير منضم. وتفاصيل إنتاجه وتبلوره. البروتوكول، يستفيد من هذا التثبيت من تأكيد الأصلي من الجزء المجال ملزم IKK من نيمو، من خلال محولات ملف الملف، والتي تسهل التبلور وتحديد الهيكل.
البيولوجيا الهيكلية من نيمو، كهدف، يوفر ميزة هامة في تطوير مثبطات NEMO لعلاج أمراض المناعة الذاتية والتهابات والسرطان. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لتحديد هيكل المجمعات NEMO، مع الببتيد أو مثبطات جزيء صغير لاكتشاف المخدرات أو التحسين. البروتين إعادة التكفير والتركيز، خلال مرحلة إنتاج البروتين، هي أساسية للحصول على خافض NEMO نقية.
الحد من التجميع وضمان القابلية للذوبان في ظل ظروف التبلور. وسوف يكون إثبات الإجراءات تمار وإيمي، طلاب الدراسات العليا في مختبرنا. تبدأ بإضافة 20 ملليلتر من محلول مرق رائع.
و 20 ميكرولترات من 100 مليغرام لكل ميل المليلتر من الأمبيسيلين. إلى قارورة 125 ملليلتر إرلينماير تليها microliters قليلة من الخلية الجلسرين الأسهم، من 80 درجة مئوية التخزين، من BL21DE3 الخلايا المختصة.
تحولت مع ناقلات. بعد هز ثقافة البداية بين عشية وضحاها، في 37 درجة مئوية و 220 التناوب في الدقيقة الواحدة، وتمييع الخلايا إلى OD600 من 0.1 و 250 ملليلتر من مرق رائع. وأضيف الأمبيسيلين إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر.
عندما تصل إلى OD600 من الثقافة 0.8 إلى 1، إضافة IPTG إلى الثقافة، إلى تركيز 500 ميكرومولار. وتنمو الخلايا لمدة أربع ساعات، في 37 درجة مئوية، حتى OD600 تصل إلى 6-10. في نهاية الحضانة ، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
وإعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر من العازلة تحلل. تقسيم الخلايا التي أعيد تعليقها إلى اثنين من 20 إلى 25 ملليلتر aliquots. واستخدام الصحافة الفرنسية لتطبيق ما يقرب من 25،000 جنيه لكل بوصة مربعة من الضغط على الخلايا، مرتين إلى ثلاث مرات لكل aliquot، في غرفة باردة.
بعد ذلك ، أضف اليوريا إلى الخلايا ، إلى تركيز نهائي من ثمانية أضراس. واحتضان حل الخلية على منصة هزاز لمدة ساعتين إلى 16 ساعة، في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي، نقل ال ليسات إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة، إلى ما لا يقل عن ثلاثة أرباع كامل، لكل أنبوب.
و (أولرتا) للطرد المركزي لمدة 45 دقيقة decant الماحشات في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. وتحميل اليوريا المحتضنة على عمود IMAC، في ثلاثة ملليلتر في الدقيقة الواحدة.
عندما يتم تشغيل كافة من supernatant خلال العمود، قم بغسل العمود 10 وحدات تخزين عمود، مع المخزن المؤقت الربط، في ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. وأداء التدرج elution من البروتين نيمو-ETAA من 10 إلى 500 إيميدازول ميليمولار, أكثر من 12 تدرج حجم العمود. جمع 1 ملليلتر aliquots من eluate ، في لوحة جمع الكسور.
بعد تحليل صفحة SDS ، اسحب الكسور التي تحتوي على البروتين المستهدف النقي وقياس تركيز البروتين عن طريق مقايسة برادفورد ، وفقًا للبروتوكول القياسي. حدد الكسور المراوغة، التي تحتوي على البروتين. لشق علامة HIS6 وإزالة imidazole الزائدة من العينة، إضافة بروتياز TEV، في نسبة الوزن واحد إلى 10، من البروتين المشقوق TEV، إلى عينة البروتين الهدف.
و تمدد العينة بين عشية وضحاها في أربعة لترات من 20 ملليمولار تريس. 150 ميليمولار كلوريد الصوديوم واثنين من ملمور DTT الحل. في صباح اليوم التالي، قم بتحميل عينة TEV المشقوقة NEMO-EEAA، على عمود IMAC الثاني، في ملليلتر واحد في الدقيقة.
جمع تدفق من خلال في كسور ملليلتر واحد، في وعاء 96 لوحة جمع الكسور. غسل العمود مع خمسة مجلدات من 20 ملليمولار تريس، 150 ميليمولار كلوريد الصوديوم و10 ميل imidazole ميليمولار، في ملليلتر واحد في الدقيقة. بعد الغسيل الأخير، elute TEV ورقم HIS6 NEMO-EEAA، مع ثلاثة مجلدات العمود من 20 ملليمولار تريس، 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم، 500 ملليمولار إيميدازول واثنين من محلول DTT ملليمولار، في قارورة 50 ملليلتر.
سحب تدفق من خلال الكسور، التي تحتوي على مشقوق NEMO-EEAA بناء وتركيز العينة مع تركيز خلية أثار، إلى خمسة ملليلتر. بعد غسيل الكلى بين عشية وضحاها كما هو موضح، تحميل خمسة ملليلتر من العينة على 16 ملليمتر من قبل 60 أعمدة الكروماتوغرافيا حجم 60 سنتيمترا. تكرار حسب الضرورة، وفقا لحجم العينة.
في ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة، وفي اثنين من تريس ملليمولار، 100 ملليمولار كلوريد الصوديوم واثنين من ملولار DDT الحل. بعد سحب الكسور، المقابلة لdimeric NEMO-EEAA، تركز العينة في مركز الخلية أثار، مع قطع الوزن الجزيئي غشاء من ثلاثة كيلودالون، إلى تركيز النهائي من 113 ميكرومولار. ثم، aliquot البروتين للتخزين في أربع درجات مئوية، لمدة تصل إلى شهر واحد.
بالنسبة لفحص المصفوفة المتفرقة، أضف 60 ميكرولترات من محلول المصفوفة المتفرقة في كل بئر من الآبار الـ 96 للوحة تبلور غرفة قطرة. للجلوس وإسقاط انتشار بخار. وإضافة محلول البروتين إلى واضع إسقاط الروبوتية.
المقبل، واستخدام واضع إسقاط الروبوتية، للاستغناء عن 100 نانولتر من محلول البروتين في 1.65 ملليغرام لكل ملليلتر، في نسبة واحد إلى واحد مع محلول الخزان في انخفاض واحد، إلى حجم النهائي من 200 نانولتر. وإضافة 66 نانولترات من محلول البروتين مع 134 نانويلتر من محلول الخزان، إلى حجم نهائي من 200 نانولتر في انخفاض اثنين. ثم، ختم على الفور لوحة مع شريط ختم واسعة ثلاثة بوصة.
ثم، تخزين الصواني في تخزين صور التبلور، في 20 درجة مئوية. التحقق من الصور التي تم جمعها تلقائيا، لوجود بلورات، بدءا من يومين بعد تخزين لوحات. لتوليد البذور الأسهم، نقل قطرة كاملة تحتوي على الكريستال من الفائدة، إلى 50 ميكرولترات من حل حالة التبلور، في القارورة المقدمة، من مجموعة جيل البذور.
ودوامة مخزون البذور، مع 20 ثانية من النبض و 10 ثوان من الراحة، لمدة ثلاث دقائق. ثم، بشكل متسلسل تمييع مخزون البذور، في واحد إلى 10 زيادات، وصولا الى واحد إلى 10،000. وتخزين التخفيفات عند أربع درجات مئوية، حتى مزيد من الاستخدام.
قبل يوم إلى يومين من الشحن إلى السنكروترون، وقطع الشريط من أعلى البئر، مع الكريستال من الفائدة. وإضافة 0.5 ميكرولترات من محلول التبلور التي تحتوي على 12٪ واحد، واثنين من البروبان ديو cryoprotectant، مباشرة إلى البئر. طرد بلطف الكريستال مع حلقة التبريد.
حلقة الكريستال من البئر، وتخزين الكريستال التي تحتوي على حلقة التبريد في عفريت مغمورة في النيتروجين السائل، حتى شحنة لالأشعة السينية حيود. بعد تلقي بيانات الحيود بالأشعة السينية، معالجة شدة تحجيم في STAR و ISO الملقم. وباستخدام فهرسة بلوروغرافية بالأشعة السينية، قطع متوسط، من 1.2 لسطح الحد من الحيود للبيانات.
و تحميل على فينيكس. لتحديد الهيكل، استخدم هيكل الأشعة السينية GCN4 كنموذج بحث للاستبدال الجزيئي، وذلك باستخدام MRage في فينيكس. سيتم تعريف هيكل 4DMD ، على أنه مجموعة.
وسوف حل MRage بناء بنجاح إلى جزء هيكل، المقابلة للمحطة النهائية ملف ملف محول من نيمو-ظا. إلى نموذج البحث، لكلا السلاسل في الخافت. يظهر البروتين عبر التعبير عنها في نطاق, في ما يقرب من 14 كيلودالتون علامة الوزن الجزيئي, قبل تنقية العمود IMAC الأولى.
ويعرض الفرقة مونومر والفرقة يمبر، في 14 و 28 كيلودالتون، على التوالي، بعد أول elution. تم الانتهاء من شق TEV عمليا، بعد elution، من خلال العمود IMAC الثاني. تقريبا تماما كما اكر، في الوزن الجزيئي المتوقع.
حجم استبعاد الكروماتوغرافيا، ويعرض ذروة واحدة، والتمادي بين 60 إلى 65 ملليلتر، الذين يستجيبون لتمين. ينتج الفحص الدقيق بلورات يمكن استخدامها لإنتاج مخزون من البذور لإنتاج بلورات NEMO-EEAA، لجمع البيانات. هنا، ممثل NEMO-EEAA بلورات ملامح حيود، وتظهر.
التحليل الهيكلي للبروتين NEMO-EEAA، يكشف عن homodimeric غير منتظمة موازية ملفوف الملف، ما يقرب من 175 انجستروم في الطول. منطقة الملفوف العادية ، تشمل تسلسل محول الملفوف المثالي ، في نهاية المطاف. وأول هبتادين من التسلسل الصحيح NEMO.
ملف ملفي عادي، موجود أيضًا في الـ C. بدءا من مخلفات NEMO 97 وتشمل محطة C محول الملفوف الملفوف. هيكل IKK بيتا ملزمة، ويعرض تأكيدا أكثر انفتاحا ملف ملفي، لاستيعاب يغاند.
مع تباعد أكبر بين تينلكال بمقدار واحد إلى 2.2 انجستروم في هذه المنطقة. هيكل ليغاند في نيمو، ويقدم هدفا جديدا لتصميم مثبطات من خلال أساليب الحساب. وللفحص البصري لجيوف الربط مع مكتبات الجزيئات الصغيرة.
لدينا الآن مسار لبلورة بناء NEMO المهندسة في مجمع مع يغاندس جزيء صغير. للمساعدة في تطوير وتحسين فئة جديدة من مثبطات.
