このプロトコルは、NEMO の IKK バインディング ドメインの構造の決定を、その非バインド形式で容易にします。そして、その生産と結晶化の詳細。このプロトコルは、このNEMOのIKK結合ドメイン断片の安定化を利用して、コイルコイルアダプタを介して、結晶化および構造決定を容易にする。
NEMOの構造生物学は、標的として、炎症性および自己免疫疾患および癌の治療のためのNEMO阻害剤の開発において重要な利点を提供する。このプロトコルは、創薬または最適化のためのペプチドまたは低分子阻害剤を用いて、NEMO複合体の構造決定に拡張されてもよい。タンパク質リフォールディングおよび濃度は、タンパク質産生段階の間に、純粋なNEMOダイマーを得るための基本である。
凝集を制限し、結晶化条件下での溶解性を確保する。手順を実証するタマルとエイミー、私たちの研究室の大学院生になります。素晴らしいスープ溶液の20ミリリットルを追加することで始めます.
そして20マイクロリットル100ミリグラムアンピシリンのミリリットルのストック溶液。125ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに。BL21DE3有能な細胞の80°C貯蔵から、セルグリセロールストックの数マイクロリットルが続く。
ベクトルを使用して変換されます。一晩スターター培養を振った後、摂氏37度と毎分220回転で、細胞を0.1と250ミリリットルの素晴らしいスープのOD600に希釈します。そして、ミリリットル当たり100マイクログラムの最終濃度にアンピシリンを加える。
培養のOD600が0.8〜1に達すると、培養物にIPTGを加え、500マイクロモル濃度にする。そして、OD600が6〜10に達するまで、摂氏37度で4時間細胞を成長させます。インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞を沈下する。
そして、40ミリリットルのリシスバッファーにペレットを再懸濁させる。再懸濁細胞を20〜25ミリリットルのアリコートに分割する。そして、フランスのプレスを使用して、冷たい部屋で細胞に圧力の平方インチあたり約25,000ポンド、アリコートあたり2〜3回を適用します。
次に、尿素を細胞ライセートに加える、8モルの最終濃度にする。そして、室温で、2〜16時間、ロッキングプラットフォーム上で細胞溶液をインキュベートします。翌朝、ライセートを超遠心チューブに移し、チューブあたり少なくとも4分の3に完全に移します。
そして、ユルタは、45分間、ライセートを遠心分離します。上清を50ミリリットルの円錐状チューブにデカントします。そして、尿素インキュベート上清をIMACカラムに1分間に3ミリリットルでロードする。
すべての上清が柱を通り抜けるときは、1分間に3ミリリットルで、結合バッファーで10カラムの体積のためにカラムを洗います。そして、12カラムの体積勾配にわたって、10〜500ミリモルイミダゾールのNEMO-EEAAタンパク質の勾配溶出を行う。溶出物の1ミリリットルのアリコートを集め、分画収集プレートに入れる。
SDSページ分析の後、純粋な標的タンパク質を含む分数を引き出し、標準プロトコルに従ってブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定する。タンパク質を含む排除された分画を選択します。HIS6タグを切断し、サンプルから余分なイミダゾールを除去するには、TEVプロテアーゼを1~10重量比で、TEV切断タンパク質の、標的タンパク質サンプルに添加する。
そして、20ミリモルトリスの4リットルで一晩サンプルを拡張します。150 ミリモル塩化ナトリウムと 2 ミリモル DTT 溶液.翌朝、TEV切断NEMO-EEAAサンプルを2番目のIMACカラムに1分あたり1ミリリットルでロードします。
96ボウル分数コレクションプレートに1ミリリットル分の分量で流れを集める。5つのボリュームの20ミリモルトリス、150ミリモル塩化ナトリウム、10ミリモルイミダゾール溶液を1分あたり1ミリリットルで洗います。最後の洗浄後、TEVを溶出し、20ミリモルトリス、150ミリモル塩化ナトリウム、500ミリモルイミダゾール、2ミリモルDTT溶液の3カラムボリュームを50ミリリットルフラスコにして、HIS6 NEMO-EEAAを解約した。
分画を通して流れを引き出し、切断されたNEMO-EEAAを含み、攪拌された細胞濃縮器でサンプルを5ミリリットルに濃縮する。一晩透析を行った後、サンプルの5ミリリットルを16ミリメートル、60センチメートルサイズの除外クロマトグラフィーカラムに積み込みます。サンプル量に応じて、必要に応じて繰り返す。
1分あたり1ミリリットル、2ミリモルトリス、100ミリモル塩化ナトリウムおよび2ミリモルDDT溶液で。分画を引っ張った後、二量体NEMO-EEAAに対応して、攪拌された細胞濃縮器にサンプルを濃縮し、分子量が3キロダルトンの膜を遮断し、最終的な濃度113マイクロモルにする。その後、摂氏4度で保存するためにタンパク質を最大1ヶ月間アリコートする。
まばらなマトリックススクリーニングのために、2つの滴室の結晶化板の96の井戸のそれぞれに60マイクロリットルのまばらなマトリックス溶液を加える。座って蒸気拡散を落とすため。そして、ロボットドロップセッターにタンパク質溶液を追加します。
次に、ロボットドロップセッターを使用して、1ミリリットル当たり1.65ミリグラムで100ナノリットルのタンパク質溶液を分配し、1滴のリザーバー溶液と1対1の比率で、200ナノリットルの最終体積に分配する。そして、134ナノリットルのリザーバー溶液を含む66ナノリットルのタンパク質溶液を、2個のドロップ中の200ナノリットルの最終体積に加える。その後、3インチ幅のシールテープでプレートを直ちに密封します。
次に、トレイを結晶化イメージャーストレージに20°Cで保存します。プレートを保管してから2日後から、結晶の存在のために、自動的に収集された画像を確認する。種子ストック生成のために、目的の結晶を含む滴全体を、50マイクロリットルの結晶化条件溶液に移し、その中にバイアルを設け、種子生成キットから。
そして、3分間、20秒間の脈動と10秒間の休息で、種子ストックを渦に入れます。次に、シードストックを1~10ずつ連続して希釈し、1~10,000まで下げます。そして、さらに使用するまで、摂氏4度で希釈液を保管してください。
シンクロトロンに出荷する1〜2日前に、目的の結晶で、井戸の上からテープをカットします。そして、12%1、2プロパンDiO凍結保護剤を含む結晶化溶液の0.5マイクロリットルを直接ウェルに加える。クライオループでクリスタルをそっと取り外します。
ウェルから結晶をループし、X線回折のために出荷するまで、液体窒素に浸したパックにクライオループを含む結晶を保管します。X線回折データを受信した後、STARおよびISOサーバでスケーリングされた強度を処理します。X線結晶学のインデックスを使用して、データの回折限界面に1.2の平均をカットしました。
そしてフェニックスにロードします。構造を決定するには、GCN4のX線構造を、フェニックスのMRageを用いて分子置換の探索モデルとして使用します。4DMD構造は、アンサンブルとして定義されます。
そしてMRageの解決はNEMO-EEAAの末端のコイルドコイル・アダプターに対応する構造部分に正常に造る。を検索モデルに対して、ダイマーの両方のチェーンに対して行います。オーバー発現タンパク質は、最初のIMACカラム精製の前に、約14キロダルトンの分子量マーカーでバンドに現れる。
そして、最初の溶出後、それぞれ14キロダルトンと28キロダルトンで、モノマーバンドとダイマーバンドを表示する。TEV切断は、溶出に続いて、第2のIMACカラムを通じて、実質的に完了する。ほぼ完全に二量体として、予想される分子量で。
サイズ排除クロマトグラフィーは、単一のピークを表示し、60〜65ミリリットルの間で、ダイマーに応答している。ファインスクリーニングは、NEMO-EEAA結晶の製造用の種子ストックを生成するために利用できる結晶を生成し、データ収集を行います。ここで、代表的なNEMO-EEAA結晶回折プロファイルが示されている。
NEMO-EEAAタンパク質の構造解析は、均質な不規則な平行コイルコイル、長さ約175オングストロームを明らかにする。通常のコイルコイル領域は、末端で理想的なコイルコイルアダプターシーケンスを包含する。そして、NEMOの適切なシーケンスの最初の2つのヘプタッド。
通常のコイルコイルは、C末に存在する。NEMO残基97から始まり、C端子理想的なコイルコイルアダプターを包含する。IKKベータ結合構造は、リガンドに対応するために、より開放されたコイルコイル確認を表示する。
この領域で 1 から 2.2 オングストロームより大きな間間間隔を使用します。NEMOにおけるリガンドの構造は、計算法を通じて阻害剤の設計のための新しいターゲットを提供する。そして、小分子ライブラリーとの結合ポケットの目視スクリーニングのため。
我々は現在、低分子リガンドとの複合体で、操作されたNEMO構築物の結晶化のための経路を持っています。新しいクラスの阻害剤の開発と最適化を支援する。
