Dieses Protokoll erleichtert die erfolgreiche Strukturbestimmung der IKK-Bindungsdomäne von NEMO in ihrer ungebundenen Form. Und Details seiner Produktion und Kristallisation. Das Protokoll nutzt diese Stabilisierung der nativen Bestätigung des IKK-Bindungsdomänenfragments von NEMO durch Coiled-Coil-Adapter, die kristallisations- und Strukturbestimmung erleichtern.
Die Strukturbiologie von NEMO als Ziel bietet einen wichtigen Vorteil bei der Entwicklung von NEMO-Hemmern zur Behandlung von entzündlichen und Autoimmunerkrankungen und Krebs. Dieses Protokoll kann auf die Strukturbestimmung von NEMO-Komplexen mit Peptid- oder kleinen Molekülinhibitoren zur Wirkstoffentdeckung oder -optimierung ausgedehnt werden. Die Proteinumfaltung und Konzentration während der Proteinproduktion sind von grundlegender Bedeutung, um einen reinen NEMO-Dimer zu erhalten.
Begrenzung der Aggregation und Gewährleistung der Löslichkeit unter Kristallisationsbedingungen. Demonstriert werden die Verfahren tamar und Amy, Absolventen in unserem Labor. Beginnen Sie mit 20 Milliliter n.F. tolle Brühe Lösung.
Und 20 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter Lagerlösung von Ampicillin. Zu einem 125 Milliliter ErlenmeyerKolben. Gefolgt von ein paar Mikroliter Zellglycerin-Bestand, aus 80 Grad Celsius Lagerung, von BL21DE3 kompetenten Zellen.
Transformiert mit Vektor. Nachdem die Starterkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt wurde, verdünnen Sie die Zellen auf eine OD600 von 0,1 und 250 Milliliter nader Brühe. Und fügen Sie Ampicillin zu einer endlichen Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.
Wenn die OD600 der Kultur 0,8 bis 1 erreicht, fügen Sie IPTG zur Kultur hinzu, zu einer Konzentration von 500 Mikromolaren. Und wachsen die Zellen für vier Stunden, bei 37 Grad Celsius, bis die OD600 sechs bis zehn erreicht. Am Ende der Inkubation, Sediment die Zellen durch Zentrifugation.
Und das Pellet in 40 Milliliter Lysepuffer wieder aufhängen. Teilen Sie die wieder suspendierten Zellen in zwei 20 bis 25 Milliliter Aliquots auf. Und verwenden Sie eine französische Presse, um etwa 25.000 Pfund pro Quadratzoll Druck auf die Zellen aufzutragen, zwei- bis dreimal pro Aliquot, in einem kalten Raum.
Als nächstes fügen Sie Harnstoff zu den Zelllysaten hinzu, zu einer endletzten Konzentration von acht Mol. Und die Zelllösung auf einer Schaukelplattform für zwei bis 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Am nächsten Morgen die Lysate auf Ultrazentrifugenrohre übertragen, auf mindestens drei Viertel voll, pro Rohr.
Und ulrta zentrifugieren die Lysate, für 45 Minuten. Dekantieren Sie die Überräube in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Und laden Sie den Harnstoff inkubierten Überstand auf eine IMAC-Säule, mit drei Milliliter pro Minute.
Wenn der gesamte Überstand durch die Spalte gelaufen ist, waschen Sie die Spalte für 10 Spaltenvolumen mit Bindungspuffer bei drei Milliliterpro Minute. Und führen Gradientenelution des NEMO-EEAA-Proteins von 10 bis 500 Millimolar Imidazol über einen Volumengradienten von 12 Säulen durch. Sammeln von einem Milliliter Aliquots des Eluats, in eine Fraktion Sammelplatte.
Ziehen Sie nach der SDS-Seitenanalyse die Fraktionen, die das reine Zielprotein enthalten, und messen Sie die Proteinkonzentration durch Bradford-Assay gemäß standardprotokoll. Wählen Sie die ausgedunsteten Fraktionen aus, die Protein enthalten. Um das HIS6-Tag zu spalten und überschüssiges Imidazol aus der Probe zu entfernen, fügen Sie teV-Protease mit einem Gewichtsverhältnis von 1 bis 10 von TEV-Spaltenprotein in die Zielproteinprobe ein.
Und erweitern Sie die Probe über Nacht in vier Liter von 20 Millimolar Tris. 150 Millimolar Natriumchlorid und zwei Millimolar DTT-Lösung. Am nächsten Morgen die TEV-Gespaltete NEMO-EEAA-Probe mit einem Milliliter pro Minute auf eine zweite IMAC-Säule laden.
Sammeln des Durchflusses in einem Milliliter-Fraktionen, in einer 96-Schalenfraktions-Sammelplatte. Waschen Sie die Säule mit fünf Volumen von 20 Millimolaren Tris, 150 Millimolar Natriumchlorid und 10 Millimolar Imidazol-Lösung, mit einem Milliliter pro Minute. Nach der letzten Wäsche, elute die TEV und uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, mit drei Säulenvolumen von 20 Millimolar Tris, 150 Millimolar Natriumchlorid, 500 Millimolar Imidazol und zwei Millimolar DTT-Lösung, in einem 50 Milliliter Kolben.
Ziehen Sie den Fluss durch Fraktionen, die gespaltetes NEMO-EEAA-Konstrukt enthalten, und konzentrieren Sie die Probe mit einem gerührten Zellkonzentrator auf fünf Milliliter. Nach der nächtlichen Dialyse, wie gezeigt, laden Sie fünf Milliliter der Probe auf 16 Millimeter mal 60 Zentimeter große Ausschlusschromatographiesäulen. Wiederholen, je nach Probenvolumen.
Bei einem Milliliter pro Minute und bei zwei Millimolaren Tris, 100 Millimolaren Natriumchlorid und zwei Millimolar-DDT-Lösung. Nach dem Ziehen der Fraktionen, entsprechend dem dimerischen NEMO-EEAA, konzentrieren Sie die Probe im Rührzellkonzentrator mit einem Molekulargewicht abgeschnittene Membran von drei Kilodalton auf eine Endkonzentration von 113 Mikromolaren. Dann aliquot das Protein für die Lagerung bei vier Grad Celsius, für bis zu einem Monat.
Für das spärliche Matrix-Screening 60 Mikroliter dünnmatrixlösung in jede der 96 Brunnen einer Zwei-Tropfen-Kammerkristallisationsplatte geben. Zum Sitzen und Tropfen Dampfdiffusion. Und fügen Sie die Proteinlösung zu einem Roboter-Tropfensetter hinzu.
Als nächstes verwenden Sie einen Roboter-Tropfen-Setter, um 100 Nanoliter Proteinlösung bei 1,65 Milligramm pro Milliliter, in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis mit Reservoir-Lösung in Tropfen eins, auf ein Endvolumen von 200 Nanolitern zu geben. Und fügen Sie 66 Nanoliter Proteinlösung mit 134 Nanoliter Reservoir-Lösung, zu einem Endvolumen von 200 Nanoliter in Tropfen zwei. Dann versiegeln Sie die Platte sofort mit drei Zoll breitem Dichtband.
Dann lagern Sie die Schalen in einem Kristallisations-Imager-Speicher, bei 20 Grad Celsius. Überprüfung der automatisch gesammelten Bilder, auf das Vorhandensein von Kristallen, beginnend zwei Tage nach der Lagerung der Platten. Übertragen Sie bei der Samenstammerzeugung den gesamten Tropfen, der den Kristall des Interesses enthält, in 50 Mikroliter Kristallisationsbedingungslösung, in der mitgelieferten Durchstechflasche, aus einem Saatguterzeugungskit.
Und wirbeln Sie den Samenstock, mit 20 Sekunden Pulsieren und 10 Sekunden Ruhe, für drei Minuten. Anschließend den Saatgutbestand in einem bis zehn Schritten seriell auf ein bis 10 000 verdünnen. Und die Verdünnungen bei vier Grad Celsius lagern, bis zur weiteren Verwendung.
Ein bis zwei Tage vor dem Versand zu Synchrotron, schneiden Sie das Band von der Oberseite des Brunnens, mit dem Kristall von Interesse. Und fügen Sie 0,5 Mikroliter Kristallisationslösung mit 12%ein, zwei Propan DiO Kryoschutzmittel, direkt in den Brunnen. Lösen Sie den Kristall vorsichtig mit einer Kryoschlaufe.
Schleifen Sie den Kristall aus dem Brunnen, und speichern Sie den Kristall enthalten Kryoschleife in einem Puck in flüssigen Stickstoff getaucht, bis versandt für Röntgenbeugung. Nach dem Empfang der Röntgenbeugungsdaten werden die skalierten Intensitäten im STAR- und ISO-Server verarbeitet. Mit Hilfe eines Röntgenkristallographie-Indexierungsmittels von 1,2 für die Beugungsgrenzoberfläche für die Daten.
Und laden Sie auf Phoenix. Um die Struktur zu bestimmen, verwenden Sie die Röntgenstruktur von GCN4 als Suchmodell für molekularen Ersatz, mit MRage in Phoenix. Die 4DMD-Struktur wird als Ensemble definiert.
Und die MRage-Lösung wird erfolgreich auf den Strukturteil aufbauen, entsprechend dem Endklemmen-Coiled-Coil-Adapter von NEMO-EEAA. zum Suchmodell, für beide Ketten im Dimer. Das überexprimierte Protein erscheint in einem Band, bei etwa 14 Kilodalton Molekulargewichtsmarker, vor der ersten IMAC-Säulenreinigung.
Und zeigt ein Monomer-Band und ein Dimer-Band, bei 14 bzw. 28 Kilodaltons, nach der ersten Elution. Die TEV-Spaltung ist nach der Elution durch die zweite IMAC-Säule praktisch vollständig. Fast ausschließlich als Dimer, beim erwarteten Molekulargewicht.
Größenausschlusschromatographie, zeigt eine einzelne Spitze, die zwischen 60 und 65 Milliliter, die auf den Dimer reagieren. Feinsieb produziert Kristalle, die zur Herstellung eines Saatgutbestands für die Herstellung von NEMO-EEAA-Kristallen für die Datenerfassung verwendet werden können. Hier werden repräsentative NEMO-EEAA Kristallbeugungsprofile gezeigt.
Die Strukturanalyse des NEMO-EEAA-Proteins zeigt eine homodimerische unregelmäßige parallele Coiled-Spule mit einer Länge von ca. 175. Der reguläre Coiled-Coil-Bereich umfasst die ideale Coiled-Coil-Adaptersequenz am Endterminus. Und die ersten beiden Heptads der NEMO richtigen Sequenz.
Eine regelmäßige Coiled-Spule ist auch an der Endstation C vorhanden. Ab NEMO-Rückstand 97 und umfasst die C-Klemme idealen Coiled-Coil-Adapter. Die IKK Beta-gebundene Struktur zeigt eine offenere Coiled-Coil-Bestätigung, um den Liganden unterzubringen.
Mit einem größeren interhelischen Abstand um eins bis 2,2 Angstroms in dieser Region. Die Struktur eines Liganden in NEMO, bietet ein neues Ziel für die Entwicklung von Inhibitoren durch Rechenmethoden. Und für das visuelle Screening von Bindungstaschen mit kleinen Molekülbibliotheken.
Wir haben jetzt einen Weg zur Kristallisation des konstruierten NEMO-Konstrukts in Komplex mit kleinen Molekülliganden. Unterstützung bei der Entwicklung und Optimierung einer neuen Klasse von Inhibitoren.
