על ידי תיוג גנטי של תאים בודדים עם חלבונים פלואורסצנטיים ועקוב אחר תאים אלה לאורך זמן, עכבר קונפטי אפשר לחוקרים לחשוף תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים רבים. הפרוטוקול שלנו ממזער את זמן ההשהיה בין איסוף רקמות להדמיה, ניתן ליישם על כל רקמה מינרלית או לא מומרת ושומר על פלואורסצנטיות במשך מספר שנים. שיטה זו שימושית מאוד עבור כל התחומים של רפואה רגנרטיבית וביולוגיה התפתחותית כי זה יכול להיות מיושם על אוכלוסיות הסלולר שונים כדי ללמוד את גורלם ואת הקינטיקה שלהם כל עוד קו Cre מתאים זמין.
ההוראות שלנו צעד אחר צעד ידגימו את הצעד המאתגר ביותר להבחין בהבדל של אותות פלואורסצנטיים הנפלטים מחלבונים פלואורסצנטיים שונים. התחל על ידי הכנת רקמת העכבר להדמיה. עבור רקמות רכות ו tibiae מינרלים ו femora מעכברים עד 45 ימים, לתקן את הרקמה precooled 3.7% פורמלדהיד PBS ולטוג אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שש שעות תוך גלגול בעדינות על מסובב.
עבור רקמות מינרליות כגון tibiae ו femora מעכברים מעל גיל 45 ימים, להכין ליטר אחד של 10% פתרון EDTA עם pH מותאם 8.05 עם נתרן הידרוקסידי לדלל את פורמלדהיד ל 3.7% באמצעות פתרון זה. לתקן את הרקמה על ידי שמירה על זה 3.7% פורמלדהיד PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, למקם אותו לתוך פתרון EDTA פורמלדהיד precooled ודגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס תוך סיבוב במשך 48 שעות, הקפד להחליף את הפתרון שלוש פעמים במהלך הדגירה.
לאחר מכן מניחים את הרקמה לתוך סוכרוז 30%, הקפד למלא את המיכל עד שוליים, בעדינות לסובב אותו לילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר, להשתמש בממטרים כדי להסיר את הרקמה מתסמת סוכרוז ולשטוף אותו בחמישה מיליליטר של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, במשך כמה שניות. מלא cryomold שכותרתו מראש עם OCT ולמקם את הרקמה בתחתית, עובד במהירות כדי למנוע את המדגם של ישיבה בטמפרטורת החדר במשך זמן רב מדי.
להטמיע את המדגם על ידי הנחת התבנית על קרח יבש ומחכה OCT להתגבש. אם הדגימות אינן בשימוש מיידי, ניתן לאחסן אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס. הסר את הבלוק מהתבנית.
החל OCT בין החלק העליון של הבלוק ואת צ'אק ו לקרר אותו קריוסטט לפחות חמש דקות או עד OCT מתגבש לחלוטין. מקדים את מחזיק הדגימה ואת מחזיק הלהב למינוס 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מניחים את הדגימה במחזיק הצ'אק ואת הלהב במחזיק הלהב, ומאפשרים להם לצייד במשך מספר דקות. לניתוח לוחיות צמיחה לאחר לידה, הכינו מקטעים שהם 30 עד 160 מיקרומטר.
השתמש קריוסטט כדי לקצץ את הבלוק לחתוך קטעי רקמה לעובי מתאים ולאסוף אותם על שקופיות. ואז האוויר לייבש את המגלשות בטמפרטורת החדר עד שהם יבשים לחלוטין ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד 36 חודשים. כאשר מוכן להשתמש בשקופית, להסיר אותו מהמקפיא ולהביא אותו לטמפרטורת החדר במחזיק שקופית.
כדי להסיר את ה- OCT, החל בעדינות PBS על השקופית עם פיפטה פסטר. במשך 160 חלקים בעובי מיקרומטר, הדגירה את השקופית במשך 15 דקות, להסיר את הנוזל ולהחיל PBS טרי במשך חמש דקות נוספות. הר את המגלשות בתסיכה של 75% thiodiethanol בטמפרטורת החדר עם 60 מילימטר אורך כיסוי מחליק.
ראשית, בחר את ערוץ RFP על-ידי לחיצה עליו בכרטיסיה ערוצים, מה שגורם לפרטי הערוץ להיות מוצגים בכרטיסיה נתיב אור. לאחר מכן לחץ על תיבת הסימון לצד T-PMT. מקם את השקופית במחזיק השקופית ומקם את רקמת העניין ישירות בין נתיב האור לעדשת המטרה.
כדי להפוך את הרקמה ללאוקלית, בטלו את הבחירה בתיבות YFP ו- CFP מתחת לכותרת הרצועות של הכרטיסיה ערוצים. בחר את ערוץ T-PMT בכותרת הרצועות ולאחר מכן לחץ על שידור חי בכרטיסייה רכישה ולהגדיל את הרווח עבור ערוץ T-PMT כדי לדמיין את בחירת הרקמה על המסך. התאם את מיקום השקופית כדי לאתר את אזור העניין ולהתמקד באמצעות ידית המיקרוסקופ המתאימה.
לאחר מכן לחץ על עצור בכרטיסיה רכישה כדי לבטל את החשיפה בלייזר. הגדר פרמטרי הדמיה בהתאם להוראות כתב היד והתאם את גודל חור הסיכה במידת הצורך. בדוק את ההתקנה כדי לוודא כי האותות המוקלטים אינם חופפים ולאחר מכן בחר את כל שלושת הערוצים בכרטיסיה ערוצים ולחץ על לחצן הצמד.
גלול בין ערוצי התצוגה בתמונה המתקבלת על-ידי לחיצה על התיבות המסומן הכחולות מעל כל ערוץ בכרטיסיה ממדים ובדוק באופן ידני חפיפה בין הערוצים על המסך. אם האותות חופפים, הסתגל מחדש לפרמטרים עד שניתן יהיה להבדיל אותם זה מזה. פרוטוקול זה שימש לתיוג כונדרוציטים בסחוס האפיפיזי ולהמחיש את התפשטות השיבוטים שלהם עם הגיל.
החלק המרכזי נקבע על ידי הדמיה של הרצועה הצולבת ושיבוטים בצלחת הצמיחה הטיביאלית הפרוקסימלית דימוי. תאים בודדים שהיו חיוביים Col2 והפכו מתויגים עם חלבונים פלואורסצנטי קונפטי על ניהול טמוקסיפן, עבר התרחבות שיבוט ולאחר מכן נשאר בצלחת הצמיחה. ניתן לדמיין את האות הפלואורסצנטי לאחר אחסון ארוך טווח.
חלקים מסוימים אוחסנו במשך יותר משלוש שנים לפני ההכנה וההדמיה. שחזור תלת מימדי נערך באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח תמונה ומיוצא כסרטון. קטע אחד שבור במהלך שלב cryosectioning מכיל אזור עם רמה כה גבוהה של recombination כי זה ימנע ניתוח שיבוט, המדגים את אחת הבעיות הנפוצות נתקל עם פרוטוקול זה.
בהתאם לשאלת המחקר שלך, באמצעות קו Cre כי במיוחד תוויות התאים שלך עניין יכול להיות חשוב מאוד. לכן, אנו ממליצים לבדוק פלואורסצנטיות בתאים אלה זמן קצר לאחר recombination. שימוש בקווי Cre בלתי ניתנים לחיסון הוא חיוני משום שקומבציה מתמשכת של דנ"א בקווי Cre בלתי ניתנים לעיכול יכולה לשנות את הפרופיל הפלואורסצנטי של התאים המסוידים ובכך למנוע ניתוח שיבוטים.
פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם הפרעות תפקודיות כגון זנים מניפולציה גנטית, טיפולים תרופתיים, התערבויות כירורגיות, כמו גם כתם פלואורסצנטיות אימונו של חלקים מוכנים.
