בסקירה זו, נדון הן בטכניקות הדמיה והן בטכניקות ביוכימיות המשמשות לחקר מיקום והרכב אונגל, כמו גם סידורים מחדש של ציטוסקלטון שנצפו במהלך היווצרות סינפסה אימונולוגית. שלבים ראשוניים של שיפוץ פעיל מאפשרים לתאי B להגדיל את פני התא שלהם ולהגדיל את כמות מתחמי האנטיגן BCR שנאספו בסינאפה. מצד שני, גיוס מקומי של lysosomes, יחד עם centrosome בממברנה הסינפטית, ניתן לזווג הפרשת lysosome, אשר ידוע כדי להקל על החילוץ של אנטיגנים משותקים.
אנטיגן ספיגה מעובד עוד יותר בתוך תאים אנדוליזום לתוך פפטידים, אשר נטענים על מולקולות MHC בכיתה II להצגה לתאי עוזר T. לכן, לימוד דינמיקת organelle הקשורים הסינפסה החיסונית היא חיונית כדי להבין כיצד תאי B מופעלים באופן מלא. שפעת חיסונית של תאי B המופעלים עם אנטיגנים משותקים מאפשרת לנו לעקוב אחר רכיבי תאים שונים וכיצד ניתן לגייס אותם לסינפסה החיסונית.
תאי B יכולים להיות מופעלים באמצעות אנטיגנים משותקים על משטח חרוזים או משטח כיסוי. חרוזים מצופים אנטיגן מוכנים על ידי דגירה ליגנדים ספציפיים עם גם גם פדים אמיניים שטופלו בעבר בגלטרלדהיד כדי להפעיל קבוצות אמינו. תן שימוש חוזר חרוזים פעילים ב-100 מיקרוליטרים של PBS ומערבולת.
בינתיים, להכין את פתרון האנטיגן על ידי הוספת 100 מיקרוגרם לכל mL של ליגנד BCR ב 150 microliters של PBS. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חרוזים פעילים לתומת האנטיגן ודגירים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. זכור, השתמש גם בליגה שאינה קשורה כפקד שלילי.
לאחר הדגירה, לשטוף חרוזים עם PBS. שאף את העל-טבעי והחלף ב-PBS. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
לאחר מכן, חסום את שלוש קבוצות האמינו על-ידי שימוש חוזר ב-500 מיקרוליטרים של פתרון של BSA. לבסוף, תן שימוש חוזר ב-70 מיקרוליטרים של PBS. כדי לחשב את הריכוז הסופי, אתה יכול להשתמש hemocytometer לספור את חרוזים.
עבור הפעלת תא B, השתמש בצינור 50 מ"ל ותאים לשימוש חוזר לריכוז של 1.5 מיליון למ"ל ב- CLICK בתוספת 5% סרום חזיר עוברי. לאחר מכן, הוסיפו 150, 000 תאי B, המתאימים ל-100 מיקרוליטרים של תערובת חרוזי התאים לכיסוי מצופה פולי-L-ליסין ב-37 מעלות לנקודות הזמן השונות. גישה שנייה להפעלת תאי B היא זריעתם על כיסויים מצופים אנטיגן.
למטרה זו, מעיל מחליק עם אנטי BCR ו B220 עם משפר את הידבקות התא. הכן את פתרון האנטיגן על-ידי הוספת אנטי-BRC ו- B220 ב- PBS לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למ"ל ו- 0.5 מיקרוגרם למ"ל, בהתאמה. לאחר מכן, להגדיר את הכיסוי מעל מכסה של 24 צלחת גם מכוסה בסרט פרפילם ולהוסיף 40 microliters של פתרון אנטיגן.
לאטום את הצלחת ולאחר מכן דגירה ב 4 מעלות לילה. כדי להתחיל את ההפעלה ב coverslip, תחילה לשטוף אותם עם PBS ולתת להם להתייבש במשך כמה דקות. לאחר מכן, הוסף 150, 000 תאי B ודגירה ב 37 מעלות עבור נקודות הזמן השונות.
בשני המקרים, בעת הפעלת חרוזים או שקופיות מצופות אנטיגן, אנו ממליצים להתחיל עם נקודת הזמן הארוכה ביותר ולאחר מכן להמשיך הקצרים יותר. לאחר שהרכבת את הכיסוי היבש על מגלשת מיקרוסקופ, באפשרותך להשתמש באפיפלואורסצנטיות או במיקרוסקופ קונפוקלי כדי להציג את הדגימות שלך, בהתאם לדרישות הרזולוציה. מקד את הדגימה באמצעות האור המשודר.
עליך לחפש שדות שבהם תאים וחרוזים מקיימים אינטראקציה ביחס אחד ויחס אחד. לתאי B המופעלים על כיסויים מכוסים אנטיגן, השתמש במטרה 100x לקבלת רזולוציה טובה יותר. עבור פרמטרים, שקול לקחת מחסנית z המכסה את התא כולו.
באפשרותך להוסיף תווית ל- actin כדי לתוחם את הגבולות התחתונים והתחתים של התא. לתאי B המופעלים עם חרוזים מצופים אנטיגן ומתייגים אותו לאורגנים המוגבלים לנקודה אחת, תוחמים תחילה שני אזורים: אזור התאים ואזור חרוזים. לאחר מכן, לזהות את המיקום או organelle על ידי נקודה ולקבל קואורדינטות לוקליזציה שלה.
צייר שני וקטורים:אחד בין מרכז התא לאיברל, והשני בין מרכז התא למרכז חרוזים. למדוד את האורך של שניהם ולמדוד את הזווית בין שני הווקטורים, המכונה כעת אלפא. בצע הקרנה עם הווקטור בין המרכז למרכז התא באמצעות Guassian של אלפא ולאחר מכן לחשב את אינדקס הקוטביות של organelle על ידי חלוקת הווקטור המוקרן, א, על ידי b.
לכן מדד קוטביות בין אפס לאחד מצביע על פנוטיפ מקוטב. ערכים בין אפס למינוס אחד מציינים פנוטיפ לא מקוטב. על מנת לקבוע את מדד הקוטביות עבור אורגנים מפוזרים יותר, כגון ליזוזומים, ניתן להשתמש באותו אלגוריתם שהוזכר קודם לכן, ולשנות את קואורדינטות לוקליזציה organelle עבור הקואורדינטות של מרכז ההמונים של התוויות, במקרה זה, lysosomes.
בדומה לניתוח שתואר קודם לכן, מדד קיטוב בין אפס לאחד מציין פנוטיפ מקוטב, ואילו ערכים בין אפס למינוס אחד מצביעים על פנוטיפ לא מקוטב. כדי לכמת את הכמות של כל organelle מגויס מקרוב הסינפסה החדשה, אתה יכול לחשב את אחוז פלואורסצנטיות organelle בחרוז. לשם כך, עליך לתפור את אזור הצפר והתא, למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות המתאימה ולאחר מכן לחלק את פלואורסצנטיות חרוזים על ידי סכום של חרוז פלואורסצנטיות התא.
תוכלו להשיג את הסכום של כל organelle כי הוא במגע עם הסינפסה החדשה. לחלופין, צייר מלבן ממול אל חרוז. השתמש במשקל המתאים לרבע מאורך התא, ולאחר מכן למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך המלבן ולחלק אותו על ידי הפלואורסצנטיות הכוללת.
אלגוריתם זה תמיד יקבל את אחוז organelle כי הוא קרוב הסינפסה החדשה, אבל לא בהכרח במגע ישיר עם הממשק. כדי לכמת את הרכיבים הקשורים לסנטרוסום במנוחה והפעלה של תאי B. בקצרה, אנו קובעים שלושה פרמטרים.
אזור התא וחרוזים, וקואורדינטות לוקליזציה centrosomal. לאחר מכן, אנו מגדירים מעגל המקיף את המרכז והפעלה ניתוח פרופיל רדיאלי ממרכז המרכז, שהוגדר בעבר. ברגע שיש לך את העלילה, לקבוע את הרדיוס שבו 70% של הפלואורסצנטיות המרבית נשמרת.
השתמש ברדיוס זה כדי לצייר עיגול המקיף את המרכז. לבסוף, לקבל צפיפות פלואורסצנטיות של רכיב הריבית באזור centrosome ואת אזור התא, ולחלק את שני הערכים כדי לקבל את יחס צפיפות פלואורסצנטי. כדי למדוד את התפלגות האורגנים בממשק הסינפסה החיסונית, זהה תחילה את האזור של תאי B במגע עם כיסוי מצופה אנטיגן.
באפשרותך להוסיף תווית ל- actin כדי לסייע לך להגדיר אזור זה. לאחר מכן, למדוד את האזור במגע עם השקופית, את הגובה ואת רוחב התא. האזור הפונה לתגית הכיסוי מצופה האנטיגן הוא מדידה של תא B המתפשט עם הפעלת תא B.
השתמש בערכי הגובה והרוחב כדי להפריד אזור מרכזי בתא, המופרד מהגבולות ברבע מהגובה וערכי הרוחב. בדרך כלל אלה תואמים כשליש מאזור התא הכולל. לבסוף, לחשב את גיוס organelle במרכז הסינפסה החדשה, חלוקת צפיפות הפלואורסצנטיות באזור המרכזי על ידי צפיפות פלואורסצנטיות של התא כולו.
ערכים חיוביים של מדד זה מצביעים על העשרת איברים במרכז הסינפסה החדשה. להיפך, ערכים שליליים מצביעים על התפלגות היקפית. כדי למדוד את התפלגות האורגנים במישורי z של תאי B המופעלים על כיסויים מצופים אנטיגן, תחילה תוחמים את הממשק הסינפטי ואת הגבול העליון של התא.
לאחר מכן, צייר קו לאורך מרכז התא ושגר את התמונה כדי לקבל תמונת XZ. למדוד את ראש התא ולחלק את התמונה לתוך 10 שברים של אותו אזור, מן הסינפסה החיסונית לגבול העליון של התא. למדוד את הפלואורסצנטיות בכל שבר z ולחשב את אחוז הפלואורסצנטיות על ידי חלוקת הפלואורסצנטיות בכל שבר z על ידי הפלואורסצנטיות הכוללת של התא.
לבסוף, התווה את אחוז עוצמת הפלואורסצנטיות לכל שבר z. שבר אחד ושתיים מייצגים את הממשק הסינפטי. להלן זרימת העבודה או הליך הבידוד המצנטרי.
השתמש ב- 20 מיליון תאי B לכל תנאי. טרום לטפל בתאים עם Cytochalasin D ו Nocodazole על פי הפרוטוקול הנדרש כדי להקל על ניתוק centrosome. לאחר מכן, צפה בתאים על-ידי שימוש חוזר בהם ב- 5 מ"ל של מאגר TBS.
חזור על הפעולה באמצעות 1 מ"ל של מאגר TBS 0.1x בתוספת 8%sucrose. תן שימוש חוזר לכדור התא עם 150 מיקרוליטרים של מאגר תיזה. צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להפריד את הציטוסול ואת organelles מן הגרעין.
בזהירות לשחזר את התא supernatant ולמקום על גבי צינור 1.5 מ"ל. מלא אותו ב-300 מיקרוליטרים של מאגר הדרגתי בתוספת 60%sucrose. דגימות צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
שלב צנטריפוגה זה חשוב לרכז את הצנטריוסום. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant עד שתגיע לממשק. וורטקס הדגימה שנותרה בצינור.
הכן שיפוע סוכרוז רציפה בצינור אולטרהצנטריפוגה על ידי כיסוי 0.45 מ"ל של 70%סוכרוז, עם 0.27 מ"ל של 50%סוכרוז, ולאחר מכן 0.27 מ"ל של 40% סוכרוז במאגר הדרגתי. מניחים את הדגימות המועשרות בסנטרוזן על מעבר הצבע לא רציפ ומכיילים את המשקל של כל דגימה במתאמים המתאימים. צנטריפוגה הצינורות ב 40, 000 גרם במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס, עם תאוצה מינימלית וללא הפסקה כדי למנוע הפרעה הדרגתית.
לאחר צנטריפוגה, בזהירות לאסוף 12 שברים עם נפח שווה. תן שוב את הדגימה עם מאגר טעינה והפעל SDS-PAGE. כדי לחקור את התפלגות האורגנים בתאי B במהלך היווצרות סינפסה חיסונית, השתמשנו בתאי 2A1.6 B המופעלים עם חרוזים מצופים אנטיגן לנקודות זמן שונות.
כפקד, תאי B הופעלו עם חרוזים המכילים ליגנד BCR שאינו קשור. לאחר מכן אנו, באמצעות כתמי שפעת חיסונית, מזהים איברים שונים, אשר משנים את לוקליזציה שלהם עם ההפעלה עם אנטיגנים משותקים. אנו מראים כאן את המרכז, שכותרתו עם אלפא-טובלין ומנגנון גולגי שכותרתו עם Rab6a.
בגרף, אנו מראים את מדד הקוטביות עבור קוטביות מנגנון centrosome ו golgi verus בכל נקודת זמן של הפעלה, שבו כל נקודה מייצגת תא אחד. במהלך ההפעלה, אנו יכולים להבחין כי מדדי הקוטביות עבור איברים אלה מגיעים לערכים הקרובים יותר ל -1, מה שמרמז על עלייה בגיוס שלהם ל- IS.Organelles המציגים התפלגות מפוזרת יותר, כגון ליסוזומים, ניתן לכמת גם באמצעות מדד קוטביות. אנו יכולים להבחין כי מדד הקוטביות של הליוסוזום יגיע לערכים חיוביים יותר עם ההפעלה, אשר נובעים מהגיוס ל- IS. אנו מראים גישה משלימה לכמת את גיוסו של lysosome כלפי הסינפסה החיסונית.
באמצעות אותו פרוטוקול של הפעלה עם חרוזים מצופים אנטיגן, גיוס lysosome ל IS חושב על ידי כימות תווית הפלואורסצנטיות של ליוזומים שגויסו לאזור המוגדר סביב חרוז או בתוך האזור הסינפטי. אנחנו יכולים לצפות בהפעלה הפתוחה. יש עלייה של lysosomes יחד לאתר של סינפסה.
כאן אנו מציגים את כימות אקטין במרכז בתאי B המופעלים עם חרוזים ספציפיים ולא ספציפיים מצופים אנטיגן. מאגר האקטין מצוין בחץ. כימות של רכיבים הקשורים לסנטרוסום, כגון actin במקרה זה, יכול להיות מיוצג על-ידי התוויית נקודה, שבה כל נקודה מייצגת תא אחד.
לאחר ההפעלה, תא B להקטין את כמות actin סביב centrosome. צעד זה חשוב לנתק את המרכז מהאזור perinuclear כדי לאפשר קיטוב שלה הסינפסה החדשה. עבור תא B מופעל על משטח מצופה אנטיגן, אתה יכול ללמוד actin שיפוץ, כמו גם גיוס של organelles לממברנה הסינפטית.
כאן אנו מראים את הניתוח של organelles, כגון מנגנון golgi ו רשתית אנדופלזמית, אשר מציגים התפלגות מרכזית והי היקפית, בהתאמה. בנוסף, אנו יכולים לחשב את אזור ההתפשטות של תאי B לאחר נקודות זמן שונות של הפעלה. לשם כך, אנו מתייגים את actin כדי להיות מסוגל להגדיר את מגבלת התא במישור XY.
בגרף, אתה יכול לראות את הגידול באזור התא לאחר 30 ו 60 דקות של הפעלה. התפלגות של organelle ניתן לחשב גם במישור XZ בהתאמה לממשק הסינפטי. הגרף מייצג את התפלגות אקטין ב- z-plane, כאשר שני המישורים הראשונים תואמים לממשק הסינפטי.
אנו יכולים להבחין כי actin הופך מועשר בתחום זה עם ההפעלה. בנוסף לניתוח הדמיה, גישה ביוכימית יכולה לשמש גם כדי ללמוד שינוי בהרכב centrosome על הפעלת תא B. אנו מראים כאן כתם מערבי מייצג של שבר המכיל centrosome מודגש על ידי מלבן בז '.
שברי סנטרוזום בודדו בשיפוע סוכרוז לא רציף וזוהו על ידי פילינג גמא-טובולין. הכתם המערבי שלהלן מציג את actin ו- Arp2 בשברים צמתים מתאי B במנוחה, אשר מתרוקנים עם ההפעלה. לימפוציטים B עוברים שינויים דינמיים בממשק הממברנה על מנת ליצור סינפסה חיסונית תפקודית.
תהליך זה ניתן ללמוד על ידי הדמיה וטכניקות ביוכימיות המתוארות כאן בסרטון זה. אנו מאמינים כי ניתוח זה יכול לספק מידע ערכי על המנגנונים המולקולריים המעורבים באופן שבו תאי B יכולים להיות מופעלים ביעילות.
