חומר פעיל שימש ביישומים שונים כמו צללים מולקולריים. כדי להביא את היישום לשלב הבא, אנחנו צריכים לפתח את היכולת לשלוט בעניין הפעיל באופן מקומי. אנו מספקים שיטה קלה לשימוש שאינו דורש שינוי של הנוזל הפעיל.
גם לא הצורך לשנות את הנתיב האופטי של מיקרוסקופ כדי להשיג את השליטה המקומית של הנוזל הפעיל. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות שבהן התגובות העיקריות לציית לחוק שגוי כגון microtubule גלישה assay או מערכות מבוססות אנזים. ההתקנה כרוכה במערכת זרימת מים.
אם מתרחשות דליפות, מים עלולים לגרום נזק למיקרוסקופ. לכן, לפני אימוץ הפרוטוקול שלנו, חשוב לוודא שהמערכת דולפת בחינם. הפרוטוקול שלנו דורש הרכבה של דגימת הזכוכית על במה בטמפרטורה.
בעוד שכתב היד מתאר את הליך ההרכבה, הוא חסר דקויות מכניות כגון אבטחת המדגם לבמה. הדגמת ההליך תהיה טיגן בייט, אדוארד ג'רוויס ומייגן וארני. טיגן ואדוארד הם סטודנטים לתארים מתקדמים, ומייגן היא סטודנטית לתואר ראשון ממעבדה.
כדי להכין נוזלים פעילים בצינור Eppendorf, לערבב 16 נקודה שבעה microliters של שמונה מיליגרם לכל microtubules מיליליטר עם שש נקודה שבעה microliters של נקודה אחת שמונה אשכולות מנוע kinesin micromolar, ונקודה אחת microliters אחד של 500 מילימולאר DTT ב M2B מלח גבוה. צרור microtubules על ידי הוספת 11 נקודה ארבעה microliters של שבעה אחוז משקל לפי משקל פוליאתילן גליקול. לאחר מכן להפעיל מנועי kinesin על ידי הוספת שתי נקודות שמונה microliters של 50 מילימולר ATP.
לשמור על ריכוזי ATP על ידי הוספת שתי נקודות שמונה microliters של המניה פירובט קינאז / לקטט דהידרוגנאז, ו 13 נקודה שלושה microliters של 200 מילימול פוסנול פירובט. להפחית את אפקט הלבנת התמונה על ידי הוספת 10 microliters של 20 מילימולאר Trolox, נקודה אחת microliters של שלוש נקודה חמישה מיליגרם לקטלאז מיליליטר, נקודה אחת microliters של 20 מיליגרם לכל oxidase גלוקוז מיליליטר, ונקודה אחת microliters של 300 מיליגרם לכל גלוקוז מיליליטר. עקוב אחר התנועה של הנוזל על ידי הוספת נקודה אחת שישה microliters של אפס נקודה אפס שני חמישה אחוז נפח על ידי חלקיקי מעקב נפח.
הוסף M2B מלח גבוה כדי להשיג נפח כולל של 100 microliters. לאחר מכן, יש לשטוף מגלשת זכוכית מצופה פוליאקרילמיד ולכסות במים DI. יבש את המשקפיים באוויר בלחץ.
מניחים את המשקפיים על משטח נקי ושטוח. חותכים ערוץ ברוחב 3 מ"מ בסרט השעווה. הרוחב הכולל הוא באותו רוחב כמו החלקת כיסוי הזכוכית ב 20 מילימטרים.
הוסף את השעווה בין השקופית לשקופית המכסה כדי ליצור ערוץ תא זרימה לנוזל. לדבוק בזכוכית לסרט שעווה על ידי הנחת קומפלקס שעווה זכוכית על צלחת חמה 80 מעלות צלזיוס כדי להמיס את השעווה. במהלך ההיתוך, לחץ על החלקת העטיפה בעדינות עם קצה פיפטה כדי לדבוק באופן אחיד את סרט השעווה על משטחי הזכוכית.
לאחר ההיתוך, מקררים את קומפלקס הזכוכית לטמפרטורת החדר. טען מיד את הנוזלים הפעילים המוכנים לערוץ הזרימה עם קצה פיפטה בזווית הרחק מפתיחת הערוץ וב במגע עם משטח החלקת הזכוכית. לאטום את התעלה עם דבק UV.
לאחר בניית הגדרת בקרת טמפרטורה, מקם את דגימת הנוזל הפעילה על משטח הספיר כאשר צד השקופית יוצר קשר עם פני השטח. אבטח את מגלשת הזכוכית עם סרט נייר. באמצעות סרט נחושת, חבר את ThermoSensor למשטח החלקת הכיסוי.
כדי לטעון את ההתקנה על שלב מיקרוסקופ, עם החלקת החלקת הכיסוי פונה לכיוון המטרות, לאבטח את ההתקנה עם מלחצי מחט שלב מיקרוסקופ. הפעל את בקר הטמפרטורה ומשאבת מיכלי הדגים. בצע את מדריך היצרנים כדי להגדיר את טמפרטורת היעד.
אפשר בקרת טמפרטורה. ותקליט את נתוני הטמפרטורה של תרמו-סנסור. תמונה המדגם עם מרווח זמן קבוע על מיקרוסקופיה פלואורסצנטי מצויד קוביית מסנן GFP כדי לפקח על חלקיקי מעקב Alexa 488 שכותרתו בתמהיל הפעיל.
התאימו את מרווח הזמן כדי לאפשר לתזוזת המעקב בין המסגרות להיות בטווח של תשעה פיקסלים. עבור עוקבי הדמיה הנעים במהירות של 10 מיקרומטרים לשנייה, באמצעות מטרה של ארבע פעמים, מרווח הזמן מומלץ להיות דקה עד חמש שניות. שמור את התמונות כקבצי TIF, תן שם לקבצים בהתבסס על מספר המסגרת ואחסן אותם בתיקיה נפרדת.
עבור קינסין זה מונחה microtubule נוזלים פעילים, הטמפרטורה נשלטה ב 10, 20, 30, ו 40 מעלות צלזיוס. התנודות בטמפרטורה היו בתוך נקודת האפס אחת עד אפס נקודה שלוש מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות המדגים את היציבות ואת האמינות של הגדרת בקרת טמפרטורה זו. מכשירי המעקב נתגמו כל שתי שניות, מה שהתמונות הרציף אפשרו למעקב אחר מסלולי מעקב.
המהירויות הממוצעות שנמדדו ב-20 עד 36 מעלות צלזיוס, נראו כמעט עצמאיות בזמן באפס עד שעתיים. איפה כמו 10 ו 40 מעלות צלזיוס, המהירויות הממוצעות נרקבו במהירות הנגרמת על ידי depolymerization microtubule מתחת 16 מעלות צלזיוס ואת אשכולות kinesin תקלה מעל 36 מעלות צלזיוס בהתאמה. כאשר טמפרטורות המערכת התחלפו בין 20 ל -30 מעלות צלזיוס כל 30 דקות, המהירויות הממוצעות של הנוזלים הפעילים לא רק להאיץ ולהאט בהתאם, אבל הם גם הגיבו לשינוי הטמפרטורה בתוך 10 שניות.
נוזלים פעילים מתחילים תקלה, כאשר מקורר מתחת 16 או מחומם מעל 36 מעלות. לכן, בעת מניפולציה בקר הטמפרטורה, להבטיח את הטמפרטורה היא בין 16 ל 36 מעלות. היכולת לכוונן נוזל פעיל באופן מקומי, מאפשרת לכוון את כוח הנוזלים כגון אספקת מטענים מנקודה A לנקודה B או פיתוח התקן microfluidity שאינו דורש שסתום פיזי.
האקרילמיד המשמש לציפוי כלי זכוכית הוא רעלן עצבי אשר יכול לספוג דרך העור. ללבוש ציוד מגן נאות כגון כפפות, חלוקי מעבדה ומ המשקפי בטיחות כדי למזער את הסיכון.
