La materia attiva è stata usata in varie applicazioni come le ombre molecolari. Per portare l'applicazione al livello successivo, dobbiamo sviluppare la capacità di controllare la materia attiva localmente. Forniamo un metodo facile da usare che non richiede la modifica del fluido attivo.
Né la necessità di modificare il percorso ottico del microscopio per ottenere il controllo locale del fluido attivo. Il nostro metodo può essere applicato a una vasta gamma di sistemi in cui le reazioni principali obbediscono alla legge errata come il saggio di planata dei microtubuli o i sistemi basati sugli enzimi. La configurazione prevede un sistema di circolazione dell'acqua.
In caso di perdite, l'acqua può danneggiare il microscopio. Pertanto, prima di adottare il nostro protocollo, è importante assicurarsi che il sistema sia privo di perdite. Il nostro protocollo richiede il montaggio del campione di vetro in una fase di temperatura.
Mentre il manoscritto descrive la procedura di montaggio, manca di sottigliezze meccaniche come fissare il campione allo stadio. A dimostrare la procedura, saranno Teagan Bate, Edward Jarvis e Megan Varney. Teagan ed Edward sono studenti laureati, e Megan è uno studente universitario di un laboratorio.
Per preparare fluidi attivi in un tubo di Eppendorf, mescolare 16 punti sette microlitri di otto milligrammi per microtubuli millilitro con sei punti sette microlitri di un punto otto micromolare chinasi cluster motore, e un punto uno microlitri di 500 millimolare DTT in M2B ad alto sale. Raggruppare i microtubuli aggiungendo 11 punti quattro microlitri del 7% di peso in polietilene glicole. Quindi attivare i motori a cinesinina aggiungendo due microlitri a otto punti di ATP da 50 millimolare.
Mantenere le concentrazioni di ATP aggiungendo due microlitri a otto punti di piruvato chinasi/lattato deidrogenasi a due punti e 13 punti tre microlitri di 200 millimolare fosfenolo piruvato. Ridurre l'effetto di sbiancamento fotografico aggiungendo 10 microlitri di Trolox millimolare, un punto uno microlitri di tre punti cinque milligrammi per millilitro catalasi, un punto un microlitri di 20 milligrammi per millilitro glucosio ossidasi e un punto un microlitri di 300 milligrammi per millilitro glucosio. Tracciate il movimento del fluido aggiungendo un punto sei microlitri di zero punto zero due cinque per cento di volume per particelle di tracciante di volume.
Aggiungere M2B ad alto sale per ottenere un volume totale di 100 microlitri. Successivamente, sciacquare uno scivolo di vetro rivestito in poliacrilammide e coprire lo scivolamento con acqua DI. Asciugare gli occhiali con aria pressurizzata.
Posizionare gli occhiali su una superficie pulita e piatta. Tagliare un canale largo tre millimetri nel film di cera. La larghezza totale è della stessa larghezza del coperchio in vetro scivolare a 20 millimetri.
Inserire la cera tra lo scivolo e lo slittamento del coperchio per formare un canale di cella di flusso per il fluido. Aderire al vetro al film di cera posizionando il complesso di cera di vetro su una piastra calda di 80 gradi Celsius per sciogliere la cera. Durante la fusione, premere il coperchio scivolare delicatamente con una punta di pipetta per aderire uniformemente al film di cera alle superfici di vetro.
Dopo l'adesione, raffreddare il complesso di vetro a temperatura ambiente. Caricare prontamente i fluidi attivi preparati sul canale di flusso con la punta della pipetta ad angolo lontano dall'apertura del canale e a contatto con la superficie dello scivolo di vetro. Sigillare il canale con colla UV.
Dopo aver costruito una configurazione di controllo della temperatura, posizionare il campione di fluido attivo sulla superficie dello zaffiro con il lato scorrevole che contatta la superficie. Fissare lo scivolo di vetro con nastro adesivo. Utilizzando nastro di rame, collegare thermosensor alla superficie di slittamento del coperchio.
Per montare la configurazione su uno stadio di microscopio, con lo scivolo di scorrimento del coperchio rivolto verso gli obiettivi, fissare la configurazione con morsetti per aghi da palco al microscopio. Accendere il regolatore di temperatura e la pompa del serbatoio del pesce. Segui la guida dei produttori per impostare la temperatura target.
Abilitare il controllo della temperatura. E registrare i dati sulla temperatura di ThermoSensor. Immagini il campione con un intervallo di tempo costante su una microscopia fluorescente dotata di un cubo filtrante GFP per monitorare le particelle di tracciante etichettate Alexa 488 nel mix attivo.
Regola l'intervallo di tempo per consentire lo spostamento del tracciante tra i fotogrammi entro nove pixel. Per i traccianti di imaging che si muovono a 10 micrometri al secondo, utilizzando un obiettivo quattro volte superiore, si consiglia che l'intervallo di tempo sia da uno a cinque secondi. Salvare le immagini come file TIF, denominare i file in base al numero di fotogramma e archiviarli in una cartella separata.
Per questi fluidi attivi basati su microtubuli guidati dalla cinesicina, la temperatura è stata controllata a 10, 20, 30 e 40 gradi Celsius. La fluttuazione della temperatura è stata entro il punto zero da uno a zero punti tre gradi Celsius per quattro ore dimostrando la stabilità e l'affidabilità di questa configurazione di controllo della temperatura. I traccianti venivano immagini ogni due secondi, che le immagini sequenziali permettevano di tracciare le traiettorie del tracciante.
Le velocità medie misurate da 20 a 36 gradi Celsius, sembravano essere quasi indipendenti dal tempo a zero o due ore. Dove a 10 e 40 gradi Celsius, le velocità medie sono decadte rapidamente a causa della depolimerizzazione dei microtubuli al di sotto dei 16 gradi Celsius e dei cluster di chiesina che non funzionano correttamente rispettivamente sopra i 36 gradi Celsius. Quando le temperature del sistema si alternavano tra i 20 e i 30 gradi Celsius ogni 30 minuti, le velocità medie dei fluidi attivi non solo acceleravano e decelerano di conseguenza, ma rispondevano anche al cambiamento di temperatura entro 10 secondi.
I fluidi attivi iniziano a funzionare male, quando vengono raffreddati sotto i 16 o riscaldati sopra i 36 gradi. Quindi, quando si manipola il regolatore di temperatura, assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 16 e 36 gradi. La capacità di sintonizzare localmente il fluido attivo consente di dirigere la potenza del fluido come la consegna di carichi dal punto A al punto B o lo sviluppo di un dispositivo di microfluidità che non richiede una valvola fisica.
L'acrilammide utilizzata per rivestire la vetreria è una neurotossina che può assorbire attraverso la pelle. Indossare dispositivi di protezione adeguati come guanti, cappotti da laboratorio e occhiali di sicurezza per ridurre al minimo i rischi.
