Aktif madde moleküler gölgeler gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır. Uygulamayı bir sonraki seviyeye taşımak için, aktif maddeyi yerel olarak kontrol etme yeteneğini geliştirmemiz gerekir. Aktif sıvının değiştirilmesini gerektirmeyen kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.
Ne de aktif sıvının yerel kontrol elde etmek için mikroskop optik yolu değiştirmek gerekir. Yöntemimiz, ana reaksiyonların mikrotübül süzme test veya enzim bazlı sistemler gibi hatalı yasalara uydukları geniş bir sistem yelpazesine uygulanabilir. Kurulum bir su sirkülasyon sistemi içerir.
Sızıntılar meydana gelirse, su mikroskoba zarar verebilir. Bu nedenle, protokolümüzü kabul etmeden önce, sistemin sızdırmaz olmasını sağlamak önemlidir. Protokolümüz cam örneğinin sıcaklık aşamasına monte sini gerektirir.
El yazması montaj prosedürünü açıklarken, örneği sahneye çıkarmak gibi mekanik inceliklerden yoksundur. Prosedürü gösteren, Teagan Bate, Edward Jarvis ve Megan Varney olacaktır. Teagan ve Edward yüksek lisans öğrencileri, ve Megan bir laboratuvar dan bir lisans öğrencisidir.
Bir Eppendorf tüpünde aktif sıvıları hazırlamak için, mililitre mikrotübbaşına sekiz miligramlık 16 nokta yedi mikrolitreile bir nokta sekiz mikromolar kinesin motor kümelerinin altı nokta yedi mikrolitresini ve yüksek tuzlu M2B'de 500 milimolar DTT'lik bir mikrolitreyi karıştırın. Ağırlık polietilen glikol ile yüzde yedi ağırlık 11 nokta dört mikrolitre ekleyerek paket mikrotübüller. Sonra 50 milimolar ATP iki nokta sekiz mikrolitre ekleyerek kinesin motorları etkinleştirin.
Stok pirüuvat kinaz /laktat dehidrogenaz iki nokta sekiz mikrolitre ve 200 milimolar fosfenol pirüuvat 13 nokta üç mikrolitre ekleyerek ATP konsantrasyonları koruyun. 20 milimolar Trolox 10 mikrolitre ekleyerek fotoğraf ağartma etkisini azaltmak, mililitre katalaz başına üç nokta beş miligram bir nokta bir mikrolitre, mililitre glikoz oksidaz başına 20 miligram bir nokta bir mikrolitre, ve mililitre glikoz başına 300 miligram bir mikrolitre. Hacim izleyici parçacıkları tarafından sıfır noktası sıfır iki yüzde beş hacim bir nokta altı mikrolitre ekleyerek sıvının hareketini izleyin.
Toplam 100 mikrolitre hacim elde etmek için yüksek tuz Lu M2B ekleyin. Daha sonra, bir poliakrilamid kaplı cam slayt durulayın ve DI su ile kapak kayma. Basınçlı hava ile gözlük kuru.
Gözlükleri temiz, düz bir yüzeye yerleştirin. Balmumu filminde üç milimetre genişliğinde bir kanal kes. Toplam genişlik, 20 milimetrelik cam kapak lı kapakla aynı genişliktedir.
Sıvı için bir akış hücre kanalı oluşturmak için slayt ve kapak kayma arasında balmumu ekleyin. Balmumu eritmek için 80 derece santigrat sıcak plaka üzerine cam balmumu kompleksi yerleştirerek balmumu film için cam yapıştırın. Erime sırasında, balmumu filmini cam yüzeylere düzgün bir şekilde yapıştırmak için kapağı bir pipet ucuyla hafifçe bastırın.
Yapışmadan sonra cam kompleksini oda sıcaklığına kadar soğutun. Hazırlanan aktif sıvıları, pipet ucu yla kanal açılışından uzakta ve cam slayt yüzeyi ile temas halinde bir açıyla akış kanalına derhal yükleyin. Kanalı UV tutkalla kapatın.
Bir sıcaklık kontrol kurulumu yaptıktan sonra, aktif sıvı örneğini safir yüzeye yerleştirin ve slayt tarafı yüzeye temas edin. Cam kaydırağı kağıt bantla sabitleyin. Bakır bant kullanarak, ThermoSensor'u kapak kayma yüzeyine takın.
Kuruluma mikroskop aşamasına monte etmek için, kapak kaymalı kaydırağı hedeflere bakacak şekilde, mikroskop aşaması iğne kelepçeleri ile kurulumu güvence altına alayın. Sıcaklık kontrol cihazını ve akvaryum pompasını açın. Hedef sıcaklığı ayarlamak için üreticiler kılavuzunu izleyin.
Sıcaklık kontrolünü etkinleştirin. Ve ThermoSensor sıcaklık verilerini kaydedin. Aktif karışımdaki Alexa 488 etiketli izleme parçacıklarını izlemek için GFP filtre küpüyle donatılmış bir floresan mikroskopide sabit bir zaman aralığıyla örneği görüntüleyin.
Çerçeveler arasındaki izleyici yer değiştirmesinin dokuz piksel içinde olmasını sağlamak için zaman aralığını ayarlayın. Saniyede 10 mikrometre hızla hareket eden görüntüleme izleyicileri için, dört kat nesnel kullanılarak, zaman aralığının bir ila beş saniye olması önerilir. Resimleri TIF dosyaları olarak kaydedin, dosyaları çerçeve numarasına göre adlandırın ve ayrı bir klasörde saklayın.
Bu kinesin tahrikli mikrotübül bazlı aktif sıvılar için sıcaklık 10, 20, 30 ve 40 santigrat derecede kontrol edildi. Sıcaklıktaki dalgalanma, bu sıcaklık kontrol kurulumunun kararlılığını ve güvenilirliğini gösteren dört saat boyunca sıfır noktası 1 ila sıfır noktası üç derece santigrat derece içinde ydi. İzleyiciler her iki saniyede bir görüntüleniyor ve sıralı görüntüler izleme yörüngelerini izlemek için izin veriliyor.
Ortalama hızları 20-36 santigrat derece olarak ölçülen, neredeyse zaman sıfır iki saat bağımsız olduğu ortaya çıktı. 10 ve 40 santigrat derecede ise, ortalama hızlar mikrotübül depolimerizasyonunun 16 santigrat derecenin altında olması ve kinesin kümelerinin sırasıyla 36 santigrat derecenin üzerinde arızalanması sonucu hızla çürür. Sistem sıcaklıkları her 30 dakikada bir 20 ila 30 derece arasında değiştiğinde, aktif sıvıların ortalama hızları sadece hızlanıp buna göre yavaşlamakla kalmadı, aynı zamanda sıcaklık değişimine 10 saniye içinde yanıt verdi.
Aktif sıvılar 16 derecenin altında soğutulduğunda veya 36 derecenin üzerinde ısıtıldığında arızaya başlar. Bu yüzden sıcaklık kontrol cihazını manipüle ederken, sıcaklığın 16 ila 36 derece arasında olduğundan emin olun. Aktif sıvıyı yerel olarak alabilme yeteneği, A noktasından B noktasına kargo lar teslim etmek veya fiziksel bir vana gerektirmeyen bir mikroakışkanlık cihazı geliştirmek gibi akışkan gücünü yönlendirmeye olanak tanır.
Cam kaplama için kullanılan akrilamid cilt yoluyla absorbe edebilirsiniz bir nörotoksin olduğunu. Riski en aza indirmek için eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü gibi uygun koruyucu donanımları takın.
