A matéria ativa tem sido usada em várias aplicações, como sombras moleculares. Para levar a aplicação ao próximo nível, precisamos desenvolver a capacidade de controlar a questão ativa localmente. Fornecemos um método fácil de usar que não requer modificação do fluido ativo.
Nem a necessidade de modificar o caminho óptico do microscópio para alcançar o controle local do fluido ativo. Nosso método pode ser aplicado a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei errônea, como o ensaio de deslizamento de microtúbulos ou sistemas baseados em enzimas. A configuração envolve um sistema de circulação de água.
Se ocorrerem vazamentos, a água pode danificar o microscópio. Portanto, antes de adotar nosso protocolo, é importante garantir que o sistema esteja livre de vazamentos. Nosso protocolo requer a montagem da amostra de vidro em um estágio de temperatura.
Embora o manuscrito descreva o procedimento de montagem, ele carece de sutilezas mecânicas, como fixar a amostra ao estágio. Demonstrando o procedimento, estarão Teagan Bate, Edward Jarvis e Megan Varney. Teagan e Edward são estudantes de pós-graduação, e Megan é uma estudante de graduação de um laboratório.
Para preparar fluidos ativos em um tubo Eppendorf, misture 16 pontos sete microliters de oito miligramas por microtúbulos mililitros com seis pontos sete microliters de um ponto oito aglomerados motores de cinesina micromolar, e um ponto um microliters de 500 mililitros DTT em M2B de alto sal. Microtúbulos de feixe adicionando 11 pontos quatro microliters de sete por cento de peso por peso polietileno glicol. Em seguida, ative os motores de quinase adicionando dois ponteiros de oito microlitadores de 50 mililitros ATP.
Mantenha as concentrações da ATP adicionando dois pontos oito microliters de piramato de estoque kinase/lactato desidrogenase, e 13 pontos três microliters de 200 milimônios piruvanato de fosfenol. Reduza o efeito de branqueamento fotográfico adicionando 10 microlitros de 20 milimilhas Trolox, um ponto um microlitros de três pontos cinco miligramas por catalase mililitro, um ponto um microlitros de 20 mililígras por mililitro de glicose oxidase, e um ponto um microliters de 300 miligramas por glicose mililitro. Rastreie o movimento do fluido adicionando um ponto seis microliters de zero ponto zero dois cinco por cento de volume por partículas rastreadoras de volume.
Adicione M2B de sal alto para alcançar um volume total de 100 microliters. Em seguida, enxágue um slide de vidro revestido de poliacrilamida e cubra o deslizamento com água DI. Seque os copos com ar pressurizado.
Coloque os óculos em uma superfície limpa e plana. Corte um canal de três milímetros de largura no filme de cera. A largura total é da mesma largura que a tampa de vidro desliza a 20 milímetros.
Insira a cera entre o deslizamento e o deslizamento da tampa para formar um canal de célula de fluxo para fluido. Adere o vidro ao filme de cera colocando o complexo de cera de vidro em uma placa quente de 80 graus Celsius para derreter a cera. Durante o derretimento, pressione a tampa deslize suavemente com uma ponta de pipeta para aderir uniformemente o filme de cera às superfícies de vidro.
Após a adesão, esfrie o complexo de vidro à temperatura ambiente. Carregue prontamente os fluidos ativos preparados para o canal de fluxo com a ponta da pipeta em um ângulo longe da abertura do canal e em contato com a superfície do deslizamento de vidro. Sele o canal com cola UV.
Depois de construir uma configuração de controle de temperatura, coloque a amostra de fluido ativo na superfície da safira com o lado do slide entrando em contato com a superfície. Fixar o deslizamento de vidro com fita adesiva. Usando fita adesiva, conecte o ThermoSensor à superfície de deslizamento de tampa.
Para montar a configuração em um estágio de microscópio, com o deslizamento de tampa voltado para os objetivos, fixe a configuração com grampos de agulha de estágio de microscópio. Ligue o controlador de temperatura e a bomba do aquário. Siga o guia do fabricante para definir a temperatura-alvo.
Habilite o controle de temperatura. E registo os dados de temperatura do ThermoSensor. Imagem a amostra com um intervalo de tempo constante em uma microscopia fluorescente equipada com um cubo de filtro GFP para monitorar as partículas de rastreador rotulados Alexa 488 na mistura ativa.
Ajuste o intervalo de tempo para permitir que o deslocamento do rastreador entre os quadros esteja dentro de nove pixels. Para rastreadores de imagem que se movem a 10 micrômetros por segundo, usando um objetivo de quatro vezes, recomenda-se que o intervalo de tempo seja de um a cinco segundos. Salve as imagens como arquivos TIF, nomeie os arquivos com base no número do quadro e armazene-as em uma pasta separada.
Para este microtúbulo acionado por cinesina, a temperatura foi controlada a 10, 20, 30 e 40 graus Celsius. A flutuação na temperatura foi de zero ponto um a zero ponto três graus Celsius por quatro horas demonstrando a estabilidade e confiabilidade desta configuração de controle de temperatura. Os rastreadores foram imagens a cada dois segundos, o que as imagens sequenciais permitiram para rastrear trajetórias de rastreadores.
As velocidades médias medidas de 20 a 36 graus Celsius, pareciam ser quase tempo independentes de zero a duas horas. Enquanto a 10 e 40 graus Celsius, as velocidades médias deterioraram-se rapidamente causadas pela despolimerização de microtúbulos abaixo de 16 graus Celsius e os aglomerados de cinesina com defeito acima de 36 graus Celsius, respectivamente. Quando as temperaturas do sistema foram alternadas entre 20 e 30 graus Celsius a cada 30 minutos, as velocidades médias dos fluidos ativos não só aceleraram e desaceleraram em conformidade, mas também responderam à mudança de temperatura em 10 segundos.
Os fluidos ativos começam a funcionar mal, quando resfriados abaixo de 16 ou aquecidos acima de 36 graus. Então, ao manipular o controlador de temperatura, certifique-se de que a temperatura está entre 16 e 36 graus. A capacidade de sintonizar o fluido ativo localmente, permite direcionar a potência do fluido, como entregar cargas do ponto A ao ponto B ou desenvolver um dispositivo de microfluidez que não exija uma válvula física.
A acrilamida usada para revestir vidros é uma neurotoxina que pode absorver através da pele. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas, jalecos e óculos de segurança para minimizar o risco.
