ההטרוגניות של מבני השלד היא מכשול אחד בחקר ביטוי הגנים בפיתוח סחוס ועצמות. פרוטוקול זה מספק שיטה לבידוד מדויק של רקמות סמוכות אך שונות. אנו מייעלים את המיקרו-דיסקטציה ללכידת לייזר לסחוס ולעצם באמצעות כתמים סגולים של cresyl כדי לדמיין רקמות אלה לאיסוף מדויק על ידי שמירה על שלמות RNA גבוהה לניתוח הבא.
רקמות אחרות ניתן לבודד אם cresyl סגול מספק הבחנה מספקת של רקמת היעד ואיכות RNA נשאר גבוה לאחר שיטת העיבוד שלנו. רקמות כאלה כוללות תפרים craniofacial ומותק. קריוסקציה היא המיומנות התובענית ביותר בפרוטוקול זה.
ודא כי הרקמה נותבה ומוטמעת במהירות כדי לשמור על השלמות הגבוהה ביותר של RNA. כדי להתחיל בהליך זה, לנתח את העובר או רקמה של עניין. להטמיע את המדגם בתבנית הטבעה חד פעמית עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, ולהתאים את הכיוון של הדגימה עם קצה או מחט.
להקפיא במהירות את הדגימות בקרח יבש ואמבט מתיל-2-butene. לאחר מכן, להכין מיכל מרופד עם קרח יבש על ידי הנחת יריעת רדיד אלומיניום על הקרח היבש לאחסון זמני של מגלשות מדגם ניתוח במהלך cryosectioning. מעבירים את הדגימה הקפואה הטרייה לתוך דלי הקרח היבש.
מניחים שכבה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית על מחזיק דגימת קריוסטאט, ומיד מניחים את הדגימה על גבי תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית בלחץ עדין. כאשר תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית קפואה לחלוטין, הדקו את המחזיק עם הדגימה לזרוע חיתוך ההקפאה. השאירו את הדגימה בהקפאט למשך 15 דקות כדי לצייד אותה לטמפרטורת החיתוך.
לאחר מכן, לחתוך את הרקמה בעובי של 12 מיקרומטר ולאסוף את הפרוסות על שקופיות קרום PEN. ישר מקטעים עוקבים על הממברנה. לאחר השלמת השקופית, אפשר לחלקים להתייבש במשך מספר דקות ולאחר מכן העבר את השקופית אל נייר הכסף במיכל הקרח היבש עד שכל השקופיות הנדרשות ייאספו.
אחסן את השקופיות במינוס 80 מעלות צלזיוס בתיבת שקופיות. כדי להתחיל, להכין שלושה שכותרתו 15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. מוסיפים 45 מיליליטר של 80% אתנול לכל צינור.
מניחים שלושה צינורות על קרח. מניחים צינור המכיל 45 מיליליטר של 95% אתנול וצינור המכיל 100% אתנול על קרח. לאחר מכן, להוסיף 45 מיליליטר של קסילן לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר.
להפשיר ממברנה PEN להחליק בקצרה על ידי הנחת אותו על יד כפפה, ולשטוף אותו פעמיים במשך 30 שניות בכל אחד הצינורות המכילים 80% אתנול עם תסיסה כדי להסיר את תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. לאחר מכן, להניח את השקופית על גיליון של רדיד אלומיניום. פיפטה 8 מיליליטר של 1%cresyl סגול ו 50% אתנול על השקופית וכתם במשך 30 שניות.
לשטוף את השקופית בצינור השלישי המכיל 80% אתנול במשך 30 שניות. לייבש את השקופית על ידי העברתו דרך הצינור המכיל 95% אתנול במשך 30 שניות, הצינור המכיל 100% אתנול במשך 30 שניות, ולבסוף, הצינור המכיל קסילן במשך 30 שניות. לאחר מכן, מניחים את השקופיות על מגב משימה עדין במשך חמש דקות כדי לאפשר לקסילן לנקז ולאפשר לחלקים להתייבש.
תחילה, הפעל את מיקרוסקופ המיקרו-דיסקטוריה, הלייזר והמחשב ללכידת לייזר. היכנס למחשב והתחל את התוכנה. כאשר האור הירוק דול, לחץ על הכפתור האדום כדי להפעיל את הלייזר.
כאשר האור הופך לאדום, הלייזר מוכן לשימוש. הכנס את המכסה של צינור PCR 5 מיליליטר לתוך האספן. פיפטה 50 מיקרוליטרים של מאגר מיצוי לתוך הכובע ולהכניס את התקן האיסוף לתוך המיקרוסקופ.
בחלון התקן מלקט השינוי, לחץ על לחצן הזז לנקודת התייחסות כדי להזיז את האספן לנקודת ההתייחסות. התאם את המוקד כדי להציג בבירור את נקודת ההתייחסות. לאחר מכן, לחץ על לחצן ביטול הטעינה השמאלי בסרגל הכלים כדי להוריד את מחזיק השקופית.
מקם את השקופית לתוך המחזיק כאשר מקטע הרקמה פונה כלפי מטה, והכנס את המחזיק בחזרה לבמה. לחץ על המשך בחלון דגימת השינוי. כדי להגדיר את פרמטרי הלייזר, בחר באפשרות הבקרה של תפריט הלייזר או לחץ על סמל הלייזר.
התאם את הפרמטרים הבאים כרצונך, כוח, שהוא כוחו של הלייזר, הצמצם, שהוא רוחב הלייזר והמהירות, שהוא מהירות החיתוך במצב ציור וחיתוך. התחל עם יעד 5X כדי למצוא את תחומי העניין, ולעבור למטרה המציגה בצורה הטובה ביותר את תחום העניין. בחר את הצינור לאיסוף על ידי לחיצה על הסימן על האספן, ולאחר מכן לבחור להעביר לחתוך או לצייר לחתוך.
לאחר החתך הושלם, רקמת היעד עם קרום PEN ייפול לתוך הכובע של צינור האיסוף על ידי כוח הכבידה. חזור על תהליך בחירה וחיתוך זה כדי למשוך תחומי עניין מרובים במידת הצורך. לאחר מכן, לפרוק את האספן בזהירות לסגור את צינור PCR.
מניחים את הרקמות microdissected על קרח יבש. להפשיר את הרקמות microdissected בטמפרטורת החדר, אז צנטריפוגה לזמן קצר, ולהדגיר את הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, לסובב את מאגר תיזה למטה לתוך צינור PCR 5 מיליליטר.
בצע טיפול DNase והפקת RNA באמצעות ערכת בידוד RNA, בהתאם להוראות היצרן. במחקר זה, מיקרודיסקציה לייזר אופטימיזציה של סחוס ועצמות מבוצעת, הדגשת השימוש בכתמים cresyl סגול בהליך מהיר כדי לדמיין סחוס ועצמות לאיסוף רקמות מדויק תוך שמירה על שלמות RNA גבוהה לניתוח הבא. התבוננות בשקופיות מראה כי כל הסחוסים שנבדקו הם מגנטה מוכתמת, וכל הרקמות המינרליות מוכתמות בחום או בשחור.
הן הסחוס והן העצם נבדלים בקלות מרקמות אחרות באתרים אנטומיים מרובים. הסחוס של מקל, הסחוס התבולל ואזורי העצמות המזידים נבחרים ומבודדים על ידי מיקרו-דיסקטאז' בלכידת לייזר. כדי להשיג מספיק RNA לריבוד, משוך 10 אזורים של הסחוס של מקל, 10 אזורים של סחוס קונדילרי, או ארבעה אזורים של עצם מנדיבולרית לשלושה צינורות איסוף בודדים בהתאמה.
RNA מופק לאחר מכן, ואת RNA הכולל מנותח באמצעות bioanalyzer. פרוטוקול מיקרו-דיסקטי של לכידת לייזר זה משמש ברקמות שונות בשלבים התפתחותיים שונים, ומדידות מספר תקינות ה- RNA מצביעות על איכות RNA גבוהה. לאחר מכן מבוצע ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי.
ישנם 4,006 גנים באופן משמעותי ושונה לידי ביטוי בין עצם הדם התת-תאית לבין הסחוס של מקל. גנים ספציפיים osteoblasts או osteocytes באים לידי ביטוי גבוה יותר בעצם הנדרביולרית בעוד גנים ספציפיים chondrocyte באים לידי ביטוי יותר בסחוס של מקל. בנוסף, סמנים osteoclast באים לידי ביטוי יותר בעצם המאנדיברולרית, המציין בידוד מוצלח של רקמות ממוקדות.
בעקבות הליך זה, ניתוח ביטוי גנים, כולל qPCR ו- RNA-seq, יכול להתבצע. שיטות אלה יכולות לנתח ביטוי גנים של התמליל ברקמות ספציפיות או באזורים מעניינים בתוך רקמות הטרוגניות.
