İskelet yapılarının heterojenliği, kıkırdak ve kemik geliştirmede gen ekspresyonunun incelenmesinde bir engeldir. Bu protokol, bitişik ancak farklı dokuların hassas yalıtımı için bir yöntem sağlar. Daha sonraki analizler için yüksek RNA bütünlüğünü koruyarak bu dokuları hassas toplama için görselleştirmek için krem menekşe boyama kullanarak kıkırdak ve kemik için lazer yakalama mikrodizeksiyonoptimize.
Eğer cresyl menekşe hedef doku yeterli ayrım sağlar ve RNA kalitesi bizim işleme yöntemi sonra yüksek kalır diğer dokular izole edilebilir. Bu tür dokular kraniyofasiyal dikişler ve beyin içerir. Kriyosectioning bu protokolde en zorlu beceridir.
RNA'nın en yüksek bütünlüğünü korumak için dokunun hızla parçalanıp gömülü olduğundan emin olun. Bu işlem başlamak için, embriyo veya ilgi doku incelemek. Numuneyi en iyi kesme sıcaklığı bileşiğiyle tek kullanımlık gömme kalıbına gömün ve numunenin yönünü bir uç veya iğneyle ayarlayın.
Hızlı bir kuru buz ve metil-2-butene banyo örnekleri dondurmak. Daha sonra, kriyoseksiyon sırasında diseksiyon örnek slaytlar geçici depolama için kuru buz alüminyum folyo bir levha yerleştirerek kuru buz ile kapaklı bir konteyner hazırlayın. Taze dondurulmuş numuneyi kuru buz kovasına aktarın.
Bir kriyostat numune tutucuüzerine optimum kesme sıcaklığı bileşik bir tabaka yerleştirin ve hemen nazik basınç ile optimum kesme sıcaklığı bileşik üstüne numune yerleştirin. Optimum kesme sıcaklığı bileşiği tamamen dondurulduğunda, tutucuyu numuneyle birlikte kriyostat kesme koluna sabitlayın. Kesme sıcaklığına göre dengelemek için numuneyi 15 dakika kriyostatta bırakın.
Daha sonra, 12 mikrometre kalınlığında doku bölüm ve PEN membran slaytlar üzerinde dilimleri toplamak. Membran üzerinde ardışık bölümleri hizalayın. Slayt tamamlandıktan sonra, bölümlerin birkaç dakika kurumasını bekleyin ve gerekli tüm slaytlar toplanana kadar kaydırağı kuru buz kabındaki folyoya aktarın.
Slaytları eksi 80 santigrat derecede bir slayt kutusunda saklayın. Başlamak için, üç etiketli 15 mililitre santrifüj tüpler ilerler. Her tüpe 45 mililitre %80 etanol ekleyin.
Buz üzerine üç tüp yerleştirin. Buz üzerinde % 95 etanol 45 mililitre ve% 100 etanol içeren bir tüp içeren bir tüp yerleştirin. Sonra, oda sıcaklığında 50 mililitrelik bir santrifüj tüp ksilen 45 mililitre ekleyin.
Bir PEN membranı eldivenli bir ele dayayarak kısa bir süre kızamasını ve optimum kesme sıcaklığı bileşiğinin çıkarılması için %80 etanol içeren tüplerin her birinde 30 saniye boyunca iki kez yıkayın. Sonra, alüminyum folyo bir levha üzerine slayt yatıyordu. Pipet 8 mililitre 1% cresyl menekşe ve% 50 etanol slayt üzerine 30 saniye boyunca leke.
Slaytı %80 etanol içeren üçüncü tüpte 30 saniye boyunca yıkayın. 30 saniye boyunca%95 etanol içeren tüpten geçirerek kaydırağı, 30 saniye boyunca %100 etanol içeren tüpü ve son olarak da 30 saniye boyunca ksilen içeren tüpü susuz kalın. Bundan sonra, ksilenin boşalmasını ve bölümlerin kurumasını sağlamak için slaytları beş dakika boyunca hassas bir görev sileceğiüzerine yerleştirin.
İlk olarak, lazer yakalama mikrodisese mikroskobu, lazer ve bilgisayar açın. Bilgisayarda oturum açın ve yazılımı başlatın. Yeşil ışık yandığında, lazeri etkinleştirmek için kırmızı düğmeye basın.
Işık kırmızıya döndüğünde, lazer kullanıma hazırdır. 5 mililitrelik PCR tüpün kapağını kolektöre takın. Pipet 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu kapağına yerleştirin ve toplama cihazını mikroskoba yerleştirin.
Toplayıcı aygıtını değiştir penceresinde, toplayıcıyı başvuru noktasına taşımak için başvuru noktası düğmesine taşı'nı tıklatın. Başvuru noktasını net bir şekilde görüntülemek için odağı ayarlayın. Ardından, slayt tutucusunu düşürmek için araç çubuğundaki sol boşalt düğmesini tıklatın.
Aşağı bakacak şekilde doku bölümü ile tutucu içine slayt yerleştirin ve sahne içine geri tutucu yerleştirin. Örnek değiştir penceresinde devam'ı tıklatın. Lazer parametrelerini ayarlamak için, lazer menüsünün kontrol seçeneğini seçin veya lazer simgesine tıklayın.
Aşağıdaki parametreleri istenilen şekilde ayarlayın, güç, lazerin gücü olan diyafram, lazerin genişliği ve çekme ve kesme modunda kesme hızı olan hız. İlgi alanlarını bulmak için 5X hedefiyle başlayın ve ilgi alanını en iyi şekilde gösteren hedefe geçin. Toplayıcıdaki işareti tıklatarak toplama için tüpü seçin, sonra taşıyın ve kesin veya çizin ve kesin.
Kesim tamamlandıktan sonra PEN membranlı hedef doku yerçekimi ile toplama tüpünün kapağına düşecektir. Gerekirse birden fazla ilgi alanını çekmek için bu seçimi ve kesme işlemini tekrarlayın. Bundan sonra, kolektörü boşaltın ve PCR tüpünü dikkatlice kapatın.
Mikrodiskoplu dokuları kuru buz üzerine yerleştirin. Mikrodiskoplu dokuları oda sıcaklığında eritin, sonra kısa bir süre santrifüj edin ve numuneleri 42 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, 5 mililitreLIK PCR tüp içine lysis tampon aşağı spin.
Üreticinin talimatlarına uyarak, RNA izolasyon kiti kullanarak DNa işlemi ve RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bu çalışmada, kıkırdak ve kemik optimize edilmiş bir lazer yakalama mikrodizesi yapılır, daha sonraki analizler için yüksek RNA bütünlüğünü korurken hassas doku toplama için kıkırdak ve kemik görselleştirmek için hızlı bir prosedür cresyl menekşe boyama kullanımı vurgulayarak. Slaytların gözlemi incelenen tüm kıkırdakların lekeli macenta, mineralize dokuların tümünün ise kahverengi veya siyah olduğunu göstermektedir.
Hem kıkırdak hem de kemik birden fazla anatomik noktada diğer dokulardan kolayca ayırt edilebilir. Meckel Kıkırdağı, kondizyler kıkırdak ve mandibuler kemik bölgeleri seçilir ve lazer yakalama mikrodiszeile izole edilir. Sıralama için yeterli RNA elde etmek için, Meckel Kıkırdağının 10 bölgesini, 10 koniler kıkırdağı bölgesini veya mandibular kemiğin dört bölgesini sırasıyla üç ayrı toplama tüpüne çekin.
RNA daha sonra ayıklanır ve toplam RNA bir biyoanalizör kullanılarak analiz edilir. Bu lazer yakalama mikrodiseksiyon protokolü farklı gelişim aşamalarında çeşitli dokularda kullanılır ve RNA bütünlük numarası ölçümleri yüksek RNA kalitesini gösterir. Daha sonra diferansiyel gen ekspresyonu analizi yapılır.
Mandibular kemik ile Meckel Kıkırdağı arasında anlamlı ve farklı olarak ifade edilen 4.006 gen vardır. Osteoblastlara veya osteositlere özgü genler mandibuler kemikte daha yüksek oranda ifade edilirken, kondrosit spesifik genler Meckel Kıkırdağı'nda daha yüksek oranda ifade edilir. Buna ek olarak, osteoklast belirteçleri daha yüksek mandibuler kemik ifade edilir, hedeflenen dokuların başarılı izolasyon gösteren.
Bu işlemden sonra qPCR ve RNA-seq gibi gen ekspresyonu analizi yapılabilir. Bu yöntemler, transkripsiyonun belirli dokularda veya heterojen dokularda ilgi çekici bölgelerdegen ekspresyonunu analiz edebilir.
