Неоднородность скелетных структур является одним из препятствий в изучении экспрессии генов при развитии хряща и кости. Этот протокол обеспечивает метод точной изоляции соседних, но различных тканей. Мы оптимизируем микродиссекцию захвата лазера для хряща и кости с помощью кресилового фиолетового окрашивания для визуализации этих тканей для точного сбора, поддерживая высокую целостность РНК для последующего анализа.
Другие ткани могут быть изолированы, если cresyl фиолетовый обеспечивает достаточное различие целевой ткани и РНК качество остается высоким после нашего метода обработки. Такие ткани включают черепно-мозговые швы и мозг. Cryosectioning является наиболее требовательным навыком в этом протоколе.
Убедитесь, что ткань вскрывается и быстро встраивается для поддержания высочайшей целостности РНК. Чтобы начать эту процедуру, вскрыть эмбрион или ткани, представляющие интерес. Встраивание образца в одноразовую встраиваемую форму с оптимальным температурным соединением резки и регулировка ориентации образца кончиком или иглой.
Быстро заморозить образцы в сухом льду и метил-2-бутеновой ванне. Затем подготовьте крышкой контейнер с сухим льдом, разместив лист алюминиевой фольги на сухом льду для временного хранения слайдов образца вскрытия во время криозирования. Перенесите свежий замороженный образец в ведро сухого льда.
Поместите слой оптимального разрезая температурного соединения на держатель образца криостата, и сразу же поместите образец поверх оптимального соединения температуры резки с нежным давлением. Когда оптимальное соединение температуры резки полностью заморожено, закрепите держатель с образцом в криостат режущей рукой. Оставьте образец в криостате на 15 минут, чтобы уравноть его до температуры резки.
Затем раздел ткани толщиной 12 микрометров и собирать ломтики на ПЕН мембраны слайдов. Выравнивание последовательных секций на мембране. Как только слайд будет завершен, дайте секциям высохнуть в течение нескольких минут, а затем перенесите слайд на фольгу в контейнере с сухим льдом до тех пор, пока не будут собраны все необходимые слайды.
Храните слайды при температуре минус 80 градусов по Цельсию в слайд-коробке. Для начала приготовьте три помеченные 15 миллилитровые центрифуги. Добавьте 45 миллилитров 80% этанола в каждую трубку.
Поместите три трубки на лед. Поместите трубку, содержащую 45 миллилитров этанола 95% и трубку, содержащую 100% этанола на льду. Затем добавьте 45 миллилитров ксилена в 50 миллилитровую центрифугу при комнатной температуре.
Оттепель ПЕН-мембраны слайд кратко, поместив его против руки в перчатках, и мыть его дважды в течение 30 секунд в каждой из труб, содержащих 80% этанола с волнением, чтобы удалить оптимальное соединение температуры резки. Затем положите слайд на лист алюминиевой фольги. Pipette 8 миллилитров 1%cresyl фиолетовый и 50% этанола на слайде и пятно в течение 30 секунд.
Вымойте слайд в третьей трубке, содержащей 80% этанола в течение 30 секунд. Обезвоживаемую горку, передавая ее через трубку, содержащую 95% этанола в течение 30 секунд, трубку, содержащую 100% этанола в течение 30 секунд, и, наконец, трубку, содержащую ксилен в течение 30 секунд. После этого поместите слайды на деликатный стеклоочиститель задачи в течение пяти минут, чтобы ксилен стока и дайте разделам высохнуть.
Во-первых, включите микроскоп микродиссекции захвата лазера, лазер и компьютер. Войдите на компьютер и запустите программное обеспечение. Когда зеленый свет нажат, нажмите красную кнопку, чтобы активировать лазер.
Когда свет становится красным, лазер готов к использованию. Вставьте крышку 5-миллилитровой трубки ПЦР в коллектор. Pipette 50 микролитров буфера извлечения в крышку и вставить устройство сбора в микроскоп.
В окне устройства коллектора изменений нажмите кнопку "Точка отсчета", чтобы переместить коллектор к точке отсчета. Отрегулируйте фокус, чтобы четко просмотреть точку отсчета. Затем нажмите кнопку левой разгрузки в панели инструментов, чтобы снизить держатель слайда.
Поместите слайд в держатель с тканью раздел лицом вниз, и вставить держатель обратно в сцену. Нажмите продолжить в окне образца изменения. Чтобы настроить параметры лазера, выберите вариант управления лазерным меню или нажмите на значок лазера.
Отрегулируйте следующие параметры по желанию, мощность, которая является мощность лазера, диафрагма, которая является ширина лазера, и скорость, которая является скорость резки в режиме ничьей и резки. Начните с 5X цель, чтобы найти области, представляющие интерес, и перейти к цели, которая наилучшим образом показывает области интересов. Выберите трубку для сбора, нажав знак на коллектор, а затем выбрать двигаться и вырезать или рисовать и вырезать.
Как только разрез будет завершен, целевая ткань с ПЕН-мембраной упадет в крышку трубки сбора под действием силы тяжести. Повторите этот процесс отбора и резки, чтобы вытащить несколько областей, представляющих интерес, если это необходимо. После этого выгрузите коллектор и аккуратно закройте ПЦР-трубку.
Поместите микродиссектные ткани на сухой лед. Оттепель микродиссектированных тканей при комнатной температуре, затем центрифуга кратко, и инкубировать образцы при 42 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого, спина лиза буфера вниз в 5 миллилитров ПЦР трубки.
Выполните обработку DNase и экстракции РНК с помощью комплекта изоляции РНК, следуя инструкциям производителя. В этом исследовании, оптимизированный лазер захвата микроперемида хряща и кости выполняется, подчеркивая использование крещено фиолетового окрашивания в быстрой процедуре визуализации хряща и кости для точного сбора тканей при сохранении высокой целостности РНК для последующего анализа. Наблюдение за слайдами показывает, что все исследованные хрящи окрашены пурпурным, а все минерализованные ткани окрашены в коричневый или черный цвет.
Хрящ и кость легко отличить от других тканей в нескольких анатомических участках. Хрящ Мекеля, кондилярный хрящ и области мандибулярной кости отбираются и изолируются с помощью лазерного захвата микродиссекции. Чтобы получить достаточную РНК для секвенирования, потяните 10 областей хряща Мекеля, 10 областей кондиларного хряща, или четыре области мандибулярной кости в три отдельные трубки сбора соответственно.
ЗАТЕМ извлекается РНК, и общая РНК анализируется с помощью биоанализа. Этот протокол микроперехвления лазерного захвата используется на различных тканях на разных стадиях развития, и измерения целостности РНК указывают на высокое качество РНК. Затем проводится дифференциальный анализ экспрессии генов.
Есть 4, 006 генов значительно и по-разному выражается между мибибулярной кости и хряща Мекеля. Гены, характерные для остеобластов или остеоцитов, более высоко выражены в мандибулярной кости, в то время как специфические гены хондроцитов более высоко выражены в хряще Мекеля. Кроме того, остеокластные маркеры более высоко выражены в мидибулярной кости, что свидетельствует об успешной изоляции целевых тканей.
После этой процедуры может быть проведен анализ экспрессии генов, включая qPCR и РНК-сек. Эти методы могут анализировать экспрессию генов транскриптома в конкретных тканях или областях, представляющих интерес в неоднородных тканях.
