A heterogeneidade das estruturas esqueléticas é um obstáculo no estudo da expressão genética no desenvolvimento de cartilagem e osso. Este protocolo fornece um método para o isolamento preciso de tecidos adjacentes, mas diferentes. Otimizamos a microdisseção de captura a laser para cartilagem e o osso usando coloração violeta de cresílico para visualizar esses tecidos para coleta precisa, mantendo alta integridade de RNA para análise posterior.
Outros tecidos podem ser isolados se a violeta de cresilho fornecer distinção suficiente do tecido alvo e a qualidade do RNA permanecer alta após nosso método de processamento. Tais tecidos incluem suturas craniofaciais e cérebro. Cryosectioning é a habilidade mais exigente neste protocolo.
Certifique-se de que o tecido é dissecado e incorporado rapidamente para manter a mais alta integridade do RNA. Para iniciar este procedimento, dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorpore a amostra em um molde descartável de incorporação com o composto de temperatura de corte ideal, e ajuste a orientação da amostra com uma ponta ou agulha.
Congele rapidamente as amostras em um gelo seco e banho de metil-2-buteno. Em seguida, prepare um recipiente com gelo seco colocando uma folha de alumínio no gelo seco para armazenamento temporário de lâminas de amostra de dissecção durante a criosectioning. Transfira o espécime congelado fresco para o balde de gelo seco.
Coloque uma camada de composto de temperatura de corte ideal em um suporte de espécime criostat, e coloque imediatamente o espécime em cima do composto de temperatura de corte ideal com pressão suave. Quando o composto de temperatura de corte ideal estiver completamente congelado, aperte o suporte com o espécime no braço de corte criostat. Deixe a amostra no criostat por 15 minutos para equilibrá-la à temperatura de corte.
Em seguida, se sectionie o tecido com uma espessura de 12 micrômetros e colete as fatias em lâminas de membrana PEN. Alinhe seções consecutivas na membrana. Uma vez que o slide esteja concluído, deixe as seções secarem por alguns minutos e, em seguida, transfira o slide para a folha no recipiente de gelo seco até que todas as lâminas necessárias sejam coletadas.
Armazene os slides a menos 80 graus Celsius em uma caixa de slides. Para começar, prepare três tubos de centrífuga de 15 mililitros rotulados. Adicione 45 mililitros de 80% de etanol a cada tubo.
Coloque três tubos no gelo. Coloque um tubo contendo 45 mililitros de 95% de etanol e um tubo contendo 100% de etanol no gelo. Em seguida, adicione 45 mililitros de xileno a um tubo de centrífuga de 50 mililitros à temperatura ambiente.
Descongele uma membrana PEN deslize brevemente colocando-a contra uma mão enluvada, e lave-a duas vezes por 30 segundos em cada um dos tubos contendo 80% de etanol com agitação para remover o composto de temperatura de corte ideal. Em seguida, coloque o slide em uma folha de papel alumínio. Pipeta 8 mililitros de 1%de cresito violeta e 50% de etanol no escorregador e mancha por 30 segundos.
Lave o slide no terceiro tubo contendo 80% de etanol por 30 segundos. Desidratar o slide passando-o pelo tubo contendo 95% de etanol por 30 segundos, o tubo contendo 100% de etanol por 30 segundos e, finalmente, o tubo contendo xileno por 30 segundos. Depois disso, coloque os slides em um delicado limpador de tarefas por cinco minutos para deixar o xileno drenar e permitir que as seções sequem.
Primeiro, ligue o microscópio de microdisseção de captura a laser, laser e computador. Faça logon no computador e inicie o software. Quando a luz verde estiver acesa, pressione o botão vermelho para ativar o laser.
Quando a luz fica vermelha, o laser está pronto para usar. Insira a tampa de um tubo PCR de 5 mililitros no coletor. Pipeta 50 microlitros de tampão de extração na tampa e insira o dispositivo de coleta no microscópio.
Na janela do dispositivo de coletor de alterações, clique no botão mover para referenciar o botão ponto de referência para mover o coletor para o ponto de referência. Ajuste o foco para visualizar claramente o ponto de referência. Em seguida, clique no botão de descarga à esquerda na barra de ferramentas para baixar o suporte de slides.
Coloque o slide no suporte com a seção do tecido voltada para baixo e insira o suporte de volta ao estágio. Clique para continuar na janela do espécime de alteração. Para configurar os parâmetros de laser, selecione a opção de controle do menu laser ou clique no ícone laser.
Ajuste os seguintes parâmetros conforme desejado, potência, que é a potência do laser, abertura, que é a largura do laser, e velocidade, que é a velocidade de corte no modo de saque e corte. Comece com um objetivo 5X para encontrar as áreas de interesse, e mudar para o objetivo que melhor mostra a área de interesse. Escolha o tubo para coleta clicando na marca no coletor, em seguida, escolha mover e cortar ou desenhar e cortar.
Uma vez que o corte é concluído, o tecido alvo com membrana PEN cairá na tampa do tubo de coleta por gravidade. Repita este processo de seleção e corte para puxar várias áreas de interesse, se necessário. Depois disso, descarregue o coletor e feche cuidadosamente o tubo PCR.
Coloque os tecidos microdissectados em gelo seco. Descongele os tecidos microdissectados à temperatura ambiente, depois centrífuga brevemente, e incuba as amostras a 42 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, gire o tampão de lise para baixo no tubo PCR de 5 mililitros.
Realize o tratamento DNase e extração de RNA usando um kit de isolamento de RNA, seguindo as instruções do fabricante. Neste estudo, é realizada uma microdisseção otimizada de captura a laser de cartilagem e osso, destacando o uso de manchas violetas de cresílo em um procedimento rápido para visualizar cartilagem e osso para coleta precisa de tecidos, mantendo alta integridade do RNA para análise subsequente. A observação dos slides mostra que todas as cartilagens examinadas são magenta manchadas, e todos os tecidos mineralizados estão manchados de marrom ou preto.
Tanto a cartilagem quanto o osso são facilmente distinguidos de outros tecidos em múltiplos sítios anatômicos. A cartilagem de Meckel, a cartilagem condílar e as regiões ósseas mandibulares são selecionadas e isoladas por microdisseção de captura a laser. Para obter RNA suficiente para sequenciamento, puxe 10 regiões da Cartilagem de Meckel, 10 regiões de cartilagem condílar, ou quatro regiões de osso mandibular em três tubos de coleta individuais, respectivamente.
O RNA é então extraído, e o RNA total é analisado usando um bioanalílise. Este protocolo de microdissecção de captura a laser é usado em vários tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento, e as medidas do número de integridade do RNA indicam alta qualidade de RNA. A análise diferencial da expressão genética é então realizada.
Existem 4.006 genes expressados de forma significativa e diferente entre o osso mandibular e a Cartilagem de Meckel. Genes específicos para osteoblastos ou osteocitos são mais expressos no osso mandibular, enquanto genes específicos do condrócito são mais expressos na Cartilagem de Meckel. Além disso, os marcadores osteoclasta são mais expressos no osso mandibular, indicando isolamento bem sucedido dos tecidos alvo.
Após este procedimento, pode ser realizada a análise da expressão genética, incluindo qPCR e RNA-seq. Esses métodos podem analisar a expressão genética do transcriptome em tecidos específicos ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos.
