פרוטוקול זה מקל על הבידוד וההתרבות ארוכת הטווח הניתנת לשחזור של הפטוציטים של עכברים בסביבת כריך קולגן תלת-מימדי כדי לחקור היווצרות מבנה קנוני ותגובתו לטיפול במבחנה. ברגע שהטכניקה כבר שולטת, זה שיטה מהירה להשגת כמויות גדולות של אוכלוסיית hepatocyte עכבר בר קיימא וטהור מאוד למחקרים במבחנה. הדגימה של ההליך תהיה לנקה סרנובה, טכנאית מהמעבדה שלנו.
יום לפני בידוד hepatocyte הראשי, להוסיף 100 microliters של 10X DMEM, 485 microliters של מים מזוקקים, ו 15 microliters של נתרן הידרוקסיד טוחן אחד ב 500 microliters כדי קולגן זנב חולדה אחד. בדוק את ה- pH של הקולגן המנוטרל. זה צריך להיות בערך 7.5.
בעזרת קצה פיפטי מצונן מראש של 200 מיקרוליטר, מורחים 100 מיקרוליטרים של תסכולת הקולגן המנוטרלת על כל אחת מכלי התרבות בקוטר 3.5 ס"מ על הקרח וממקמים את הכלים בתנאי תרבות סטנדרטיים למשך הלילה. למחרת בבוקר, rehydrate שכבות קולגן עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס PBS לכל מנה לפחות שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לבודד את הכבד, לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, מניחים את העכבר הרדמה על מחצלת ניתוח בתחתון supine ולהקליט את גפיים התחתון וה עליון על המחצלת.
ספוגים את הבטן עם 70% אתנול ולעשות חתך בצורת V מאזור הערווה לכל מבחן. מקפלים את העור על החזה כדי לחשוף את חלל הבטן ומ מניחים את המחצלת מתחת למיקרוסקופ חיטוי. להזיז את המעי הדק ואת המעי הגס בכיוון caudal לחשוף את IVC ולטעון מזרק שני מיליליטר עם 2.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס פתרון C.Connect המזרק ל cannula ולהשתמש ספוג כותנה ספוגה PBS ספוג כדי ללחוץ על הכבד עד הסרעפת.
מניחים תפר ספוג סביב IVC ממש מתחת לכבד. לאחר מכן באמצעות מזרק אינסולין מצויד מחט 30 מד כפוף לזווית של 45 מעלות, להזריק 10 microliters של 5, 000 יחידות למיליליטר של הפרין לתוך וריד הפורטל. כדי cannulate הכבד, להשתמש מספריים מיקרוכירורגיים לעשות חתך קטן IVC ישירות ליד הכבד ולהכניס את cannula לתוך החתך.
לאבטח את cannula במקום עם תפרים ושני קשרים כירורגיים לחתוך את וריד הפורטל כדי לאפשר את מאגרי זלבן לזרום החוצה מהכבד. ואז לאט לדכא את הבוכנה מזרק לבלבל את הכבד עם שני מיליליטר של הפתרון על פני תקופה של כ 15 שניות. כאשר כל הפתרון נמסר, מראש למלא משאבה peristaltic עם פתרון טרי 37 מעלות צלזיוס C ולבדוק את מנגנון זלוב כדי להבטיח כי אין בועות אוויר במערכת.
בזהירות לנתק את הצינורית מן המזרק במהירות אך בזהירות לחבר את צינורות המשאבה peristaltic פועל לתנולה. מיד להתחיל את התדלוק בקצב זרימה של 2.5 מיליליטר לדקה. לאחר שתי דקות, לעבור פתרון D ולהמשיך את חליטה במשך 10 דקות נוספות.
בסוף החיסון, בזהירות לקצור את הכבד לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס פתרון E.To לבודד את hepatocytes העיקרי, מחזיק את הכבד על ידי הצינור, לשפשף את הרקמה סביב הקיר של הצינור כדי להפיל את hepatocytes לתוך החיץ. כאשר כל הרקמה כבר מעוך, להעביר את תרחיף הרקמה לתוך מסננת ניילון נקבובית 70 מיקרומטר כדי לסנן את התאים המבודדים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. מסיסים את תאי הכבד בצנטריפוגה ומבזבזים מחדש את גלולת הכדור ב-20 מיליליטר של 40% פרקול ב-DMEM.
להפריד את התאים חיים ומתים על ידי צנטריפוגה לשימוש חוזר את גלולה ב 20 מיליליטר של פתרון E.After צנטריפוגה התאים שוב, resuspend את גלולה ב 10 מיליליטר של פתרון טרי E לספירה. לאחר הספירה, התאימו את ספירת ההפטוציט העיקרית ל-3.75 פעמים 10 לחמשת התאים בני-קיימא למיליליטר של מדיום תרבות הפטוציט. כדי לתרבת את hepatocytes העיקרי מבודד כריכי קולגן 3D, להשתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי להפיץ באופן שווה שני מיליליטר של תאים על כל צלחת מצופה קולגן 3.5 ס"מ קוטר.
מניחים את התאים באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות. במהלך הדגירה, להכין 100 microliters של קולגן זנב חולדה מנוטרל פתרון אחד לכל מנה כפי שהוכח. בסוף הדגירה, החלף בזהירות את התאים הבינוניים והבלתי מחוברים ב-100 מיקרוליטרים של קולגן מנוטרל לכל מנה והחזר את הצלחות לאנקובטור תרבות התאים למשך שעה.
כאשר הקולגן התגבש, מוסיפים בזהירות שני מיליליטר של מדיום תרבות הפטוציט טרי לכל מנה ומחזירים את התרבויות לחממה במשך שלושה עד שמונה ימים בודקים את התרבויות מדי יום תחת המיקרוסקופ. לחיסון של ההפטוציטים העיקריים בתוך כריכי הקולגן תלת מימדיים, שטפו כל כריך בזהירות עם 37 מעלות צלזיוס PBS ותקנו את התרבויות עם מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף קיבעון, לשטוף את הכלים שלוש פעמים במשך 10 דקות בשני מיליליטר של PBS בתוספת 0.1% Tween 20 לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל את התאים עם מיליליטר אחד של 0.1 גליצין טוחן ו 0.2% טריטון X-100 ב PBS במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות PBS בתוספת Tween 20 כפי שהודגם רק. לאחר מכן, השתמשו בקצה עומס של 10 מיקרוליטר המחובר לוואקום כדי להפריע בעדינות לשכבה העליונה של הקולגן ולחסום כל כריכה לא ספציפית עם מיליליטר אחד של אלבומין סרום בקר של 5% ב-PBS Tween למשך שעתיים. בסוף הדגירה, מוסיפים את הנוגדנים העיקריים של עניין מדולל פתרון חסימה לכל מנה דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, לשטוף את הכלים עם שלוש שטיפות 15 דקות ב PBS Tween ואחריו תיוג עם הנוגדנים המשניים המתאימים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש שעות. בסוף הדגירה, לשטוף את התרבויות פעמיים עם PBS Tween ופעם אחת עם מים מזוקקים כפי שהודגם לפני הרכבה על המנה עם מדיום הרכבה נגד דעיכה עבור מיקרוסקופיה. בתוך יום אחד של זריעה בכריכים קולגן 3D, hepatocytes הראשי העכבר יצר אשכולות מאורגן עצמית ברשת קבועה בערך של canaliculi מרה.
בתוך שלושה עד שישה ימים, אשכולות של חמישה עד עשרה תאים נצפו בדרך כלל עם hepatocytes מקוטב לחלוטין להרכיב רשת canalicular. טיפול בתרופות משנות רעלים או ציטוסקלטון גורם לשינויים ברוחב, הצורה והמספר של הפטוצית ציטוסקלטון ומרה. למרות טיפול אתנול מציג רק השפעה קלה על הארגון של קרטין 8, זה מגביר את צב והפצה של רוחב תעלת מרה.
עוצמת האות של כתמי ZO-1 יורדת באתנול שטופלו באתנול canaliculi בהשוואה לפקדים לא מטופלים המצביעים על אובדן צמתים מסוג לאחר טיפול באתנול. העיכוב של התכווצות actomyosin עם Blebbistatin גורם להיווצרות של בצורת פרועה, עבה, מעובב מרה canaliculi. בנוסף, טיפול בחומצה אוקאדית מעכב פוספטאזות המשפיעות מאוד על המאפיינים הפיזיים של קרטין וכתוצאה מכך canaliculi מרה כי הם הצטמצמו באופן משמעותי בהשוואה פקדים מטופלים.
יתר על כן, טיפול באתנול מרומם באופן משמעותי את רמות של אלנין והן אספרטאט אמינו transferases מציע פגיעה hepatocellular חמור בעוד טיפול Blebbistatin אינו מוביל כל שינויים בחשבון ברמות transaminase וטיפול חומצה okadaic מפעילה שינויים ביוכימיים קלים אמינוטרנספראז אלנין אבל אין שינוי בביטוי אספרטט aminotransferase. חשוב להמשיך לעבוד מהר יחסית במהלך ההתכון ובתחילת החיסון ולהימנע מבועות הנכנסות למערכת החיסון. lysates התא ניתן לאסוף בארות כפולות עבור חלבונים של עניין כדי לקבוע אם שינויים בביטוי חלבון ו / או שלבי ההפעלה להתרחש במהלך הטיפול.
