השימוש בתאי שסתום עכבר מבודדים חיוני כדי לחקור את מסלול האיתות המוביל להסתיידות שסתום בשימוש בתאים מהונדסים גנטית מעכברים מהונדסים. העיכול הדו-שלטי הוא שיטה מהירה ויעילה. החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול זה הוא בידוד שסתום אבי העורקים משמונה שבועות עכברים.
עדיף להתאמן על עכברים מבוגרים כדי לדמיין את שסתום אבי העורקים טוב יותר. לפני תחילת הניסוי, לנקות ולחטא את כל המכשירים הכירורגיים ואת סביבת העבודה עם 70% אתנול ו autoclave המכשירים כירורגיים במשך 30 דקות. כאשר ההתקנה הראשונית מוכנה, להתחיל עם ניקוי החזה ואת אזור הבטן של עכבר מורדם בן שמונה שבועות באמצעות אתנול.
באמצעות מספריים, לפתוח את הבטן ואת החזה של העכבר, ולאחר מכן לחתוך בין האטריום השמאלי ואת החדר השמאלי עם מספריים כירורגיים קטנים. הסר דם מהלב על ידי זלוף 10 מיליליטר של PBS קר לחתוך את הלב, שמירה על שלושה מילימטרים של אב העורקים עולה. תחת סטרימוקרופ, לנתח את שסתום אבי העורקים על ידי חיתוך הלב אופקית באמצע החדרים וחיתוך החדר השמאלי לכיוון אבי העורקים, ולאחר מכן לנתח בזהירות את שסתום אבי העורקים.
איחדו את השסתומים בצלחת קטנה של תרבית רקמות 35 מ"מ. לשטוף את השסתומים המבודדים בצלחת תרבית תאים 75 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של HEPES קר מוכן טרי 10 מילימולר בתוספת אנטיביוטיקה ודגרה בחמישה מיליליטר של קולגנאז סוג אחד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד מתמשך. לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות, ב 150 פעמים G ולשטוף את הכדור פעם אחת עם שני מיליליטר של HEPES 10 מילימולר עם מערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות.
לאסוף את המתלים הנובעים מן הצינור לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ ולהשתמש פינצטה דקה להעביר בזהירות את שברי הרקמה לתוך צינור טרי. ואז לדגור את הכדור בצינור 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של קולגנאז סוג אחד ב 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמשכת במשך 35 דקות. הפרד את התאים על ידי שימוש חוזר עם פיפטה אחת מיליליטר וצנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
נקה את התאים פעמיים על ידי שימוש חוזר בגלולה המופרדת בשני מיליליטרים של DMEM מלא וצנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לציפוי, resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיום שלם ולהוסיף אותו לבאר אחת של צלחת תרבית התא שש היטב בכמות מינימלית של בינוני. שמור את הלוחות ללא הפרעה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר שלושה ימים של דגירה, לאשר צמיחה קרוב לפסולת הרקמה על ידי התבוננות בתאים מתחת למיקרוסקופ. פעם 1, 000 תאים נראים, בזהירות להסיר את פסולת הרקמה עם פינצטה autoclaved ולשנות את המדיום. Trypsinize התאים לאחר שהגיע 70% conהשפעה ולהעביר אותם צלחת תרבית רקמות 75 מיליליטר.
לפני תחילת ההסתה, נקו את מכסה המנוע הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול וחמימו את ה-DMEM בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, זרע 100, 000 תאים לכל תנאי לתוך שש לוחות באר ב DMEM מלא ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, להחליף את המדיום supernatant עם בינוני מסויד ודגורת התאים במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, להחליף את המדיום ביום השלישי.
לאחר שבעה ימים, למדוד את ריכוז הסידן בצלחת 96 היטב באמצעות ריאגנט ארסנזו השלישי ולרשום את הספיגה ב 650 ננומטר. בניתוח הייצוגי, פנוטיפים שונים של תאי שסתום זוהו עם כתמים חיסוניים לאחר שלושה עד חמישה ימים של תרבות. עכבר VIC של מבוטא vimentin ואלפא SMA, הסמנים המשמעותיים של תאי שסתום.
בנוסף, מכתמים אימונופלואורסצנטיים CD31 אימתו ללא זיהום מתאי אנדותל בתרבית VIC. Culturing VIC של עם פוספט עשיר הסתיידות מדיום לעורר הסתיידות בתאים, עוד יותר אישר עם כתמים חיוביים אדומים עבור צמתי סידן. הפרוטוקול מבוסס על מאגר של שלושה עד חמישה שסתומים מעכברים שונים.
השימוש בהמלטה ושלושה שכפולים ביולוגיים שונים חשוב כדי לאמת את הממצאים. השימוש בתאי שסתום עכבר חיוני כדי להבין את המסלול המולקולרי המוביל היצרות אבי העורקים על ידי בידוד תאים מעכברים מהונדסים. פרוטוקול זה שימש בעבר כדי לחקור את המשמעות של מסלול קולטן רגרסיה מינרלית של שסתום אבי העורקים מסויד.
