מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום תחת מספר הפרס UL1TR003096 (MDE), מלגת הלב, הריאות והמכון הלאומי למחלות ריאה 5T32HL134640 (MLD).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם.
1. פרוטוקול ניסיוני
<ol><li>הקרב את העכבר באמצעות שיטת IACUC מאושרת. כאן, השתמשנו נקע צוואר הרחם של עכבר הרדמה עם 5% isoflurane. השתמש בעכבר מתאים למחקר; כאן, אנו משתמשים בעכבר FVB בן 8 שבועות</li>
	<li>באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך אופקי 3.5-5 מ"מ באמצע הבטן התחתונה. לאחר מכן, הכנס מספריים כירורגיים לתוך החור הקטן שנוצר חתך לחתוך אנכית במעלה קו האמצע המרכזי רק מתחת לצוואר של העכבר.</li>
	<li>משוך את העור לאחור עם האצבעות ולבדוק את בלוטות הלימפה בבית השחי.</li>
	<li>באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך לרוחב 3.5 מ"מ כדי לפתוח את חלל הבטן, ולאחר מכן לחתוך בכיוון החזית עד לתחתית בית החזה. בדוק את האיברים בחלל הבטן: כבד, טחול, כליות וכו '.</li>
	<li>עם הדירה של מספריים כירורגיים, או באמצעות מלקחיים, להזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת. בדוק את הסרעפת לצמיחה הגידול או גרורות. לאחר מכן, בעדינות לצלוך את הסרעפת בצד ימין של המפעיל, ומאפשר לו להתרחב. חותכים בעדינות את הסרעפת מימין לשמאל כדי לחשוף את חלל בית החזה והריאות. תיזהר לא לחתוך את הריאות.</li>
	<li>חותכים דרך הקיצוניות לרוחב של כלוב הצלעות השמאלי (בצד ימין של המפעיל) כדי לבדוק את האונה השמאלית של הריאות.</li>
	<li>בעדינות להזיז את האונות הימניות של הריאה מהדרך לחתוך את הקיצוניות לרוחב של כלוב הצלעות הימני ולהסיר כלוב צלעות. הערה: הסרת כלוב הצלעות היא אופציונלית, אם כי ההסרה מאפשרת תצוגה ברורה יותר של אינפלציית ריאות מאוחרת יותר.<ol>
<li>אם יש צורך ברקמת ריאה טרייה או קפואה, יש להשתמש במלקחיים של המוסטט כדי להדק את הסימפונות של האונה השמאלית ולכרות את הריאה השמאלית באמצעות מספריים כירורגיות לפני הזלוף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות מלקחיים כדי להרים את הרקמה מכסה את קנה הנשימה, לחתוך כל רקמה עודפת. ואז לחתוך בעדינות את הרקמה הדקה רירית קנה הנשימה כדי לחשוף את דרכי הנשימה.</li>
	<li>חותכים דרך עורק הכליה עם מספריים כירורגיים.</li>
	<li>כדי לעיין בריאות, להשתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 22 G להזריק 1x PBS עם 10 U / mL הפרין לתוך החדר הימני של הלב. לאט לחלחל את הריאות בערך 300 μL / s עם PBS / הפרין. הריאות יהפכו לעתים קרובות ללבנות. 2.5 מ"ל של PBS משמשים בדרך כלל בשלב זה.</li>
	<li>לאינפלציית ריאות, השתמש במזרק 3 מ"ל עם מחט 22 גרם, הפעם מוחזק במקביל לקנה הנשימה. הכנס את המחט לתוך קנה הנשימה ולהזריק 10% פורמלין עם קצב זרימה לא יותר ~ 200 μL / s עד הריאות יש מנופח לחלוטין. ברגע שהריאות מנופחות, הפורמלין יחזור לזרום מקנה הנשימה. החזק את המחט במקום עוד כמה שניות ולאחר מכן לסגת.<ol>
<li>(אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לפני משיכת מחט ואינפלציה ריאות, להשתמש בחוט תפר כדי לקשור את קנה הנשימה. כדי להשיג זאת, השתמש 4 סנטימטרים של חוט תפר מחזיק את הנקודה של החוט עם זוג קטן של מלקחיים. מניחים את החוט בצד הגבי של קנה הנשימה ולמשוך דרך לעשות לולאה סביב המחט. לאחר מכן ליצור קשר מעל פני המחט. משוך קשר חזק, להסיר מחט מקנה הנשימה, קשר קרוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש מלקחיים כדי להרים את הלב, להכניס מספריים כירורגיים ישירות מאחורי הריאות, לחתוך רקמת חיבור תוך הרמת הלב כדי לכרות ריאות.</li>
	<li>חותכים את הלב כדי להסיר אותו מהריאות.</li>
	<li>מניחים את הריאות קלטת עם מזהה העכבר או מזהה המחקר. ניתן להשאיר את הריאות בתיקון במשך למעלה משנה במידת הצורך.</li>
	<li>מעבירים את הקלטת המכילה את הריאות ל-70% אתנול וממשיכים לעיבוד היסטולוגיה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההליך המתואר לעיל עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר הוא אידיאלי עבור הכנה מהירה ויעילה של ריאות העכבר עבור היסטולוגיה גידול ריאות וניתוח פתולוגיה. ההליך אינו דורש כל ציוד מיוחד והוא יכול להתבצע בתוך פחות מ 6 דקות לכל עכבר. ההליך אינו דורש נפח קבוע לאינפלציה או לחץ נוזלים מתמיד. מכיו?...

קיימים מגוון דגמי עכברים של אונקוגנזה ריאה וגרורות סרטן לריאה, החל מ- GEMMs מורכבים ועד דגמים הנגרמים על ידי מסרטן ועד מודלים סינגניים ושנאת זרים, שבהם מוזרקים תאים סרטניים באמצעות אינטרקרדיאק, תוך-עורית, וריד הזנב או שיטות אחרות לביסוס גידולים בריאה. כל המודלים האלה חולקים את הצורך המשותף להערכה היסטולוגית של היסטולוגיה של ריאות ופתולוגיה. לכן, יש צורך בשיטה חזקה אך מהירה לבצע necropsies של עכברים תוך זלוף הריאות כדי להסיר דם עודף, ניפוח ותיקון הריאות כדי לדמיין בבירור את ארכיטקטורת הריאות. מהירות היא מרכיב קריטי של הליך זה כפי שייתכן שיהיה צורך לאסוף את הריאות מעשרות עכברים בנקודת זמן אחת. ניתן לבצע הליך זה בפחות מ- 6 דקות לכל עכבר.
בעוד הליך זה הוא יותר ממספיק להערכת היסטולוגיה הגידול, זה לא מומלץ עבור אלה המעוניינים לבצע מדידות סטריאולוגיה או morphometric של הריאות. מדידות כאלה דורשות אינפלציית ריאות להיות סטנדרטית, כמו גם את החישוב של שטח הפנים המוחלט של הריאה, נפח מוחלט, וגודל מכתשי ומספר1. שיטה זו גם אינה אופטימלית עבור גישות הדמיה מסוימות. לדוגמה, הדמיה של הריאות באמצעות μCT לניתוח מורפומטרי אקס ויוו דורשת שהריאות יישארו מלאות באוויר2. כאשר שימור המרחבים והממדים האוויריים הם הדאגה העיקרית, מומלץ לתקן את הריאות על ידי טכניקות התייבשות זלוף3,4. אחד החששות הגדולים ביותר של מודל זה הוא הפוטנציאל לקרע של קירות מכתשים, להפחית את השימוש בו במחקרים של נפחת; עם זאת, ההליך המומלץ לקיבעון הריאות לחקר אמפיזמה עדיין דומה למדי, שכן מומלץ לתקן את הריאות או על ידי החדרה תוך-טרה-סחית של 10% פורמלין (בדומה לפרוטוקול המתואר כאן) תחת לחץ נוזלים מתמיד או על ידי קיבוע5.
היתרון של ההליך המתואר כאן הוא שזה לא דורש לחץ נוזלים מתמיד, במקום לנפח את הריאות עד שהם התרחבו באופן מלא, ובכך להקטין את הזמן הדרוש להליך. ההליך המתואר כאן דומה מאוד לשיטות המומלצות על ידי חימוש של האגודה לפתולוגיה טוקסיקולוגית, שם הוקמה ועדת משנה להמליץ על השיטות הטובות ביותר של קיבוע ריאות למחקרי רעלים. רוב המדענים בתוך ועדת משנה זו המליצו לתקן את הריאות על ידי החדרה תוך-סטריאלית עם מזרק, אם כי היו המלצות שונות בזמן שהריאה הושארה בקיבעון6. לכן, בעוד מגוון שיטות של אינפלציה ריאות קיבעון קיים, השיטה המתוארת בזאת מוצע להיות השיטה האופטימלית במהירות לנפח ולתקן את הריאות להערכה היסטולוגית גידול במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>10% buffered formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245685</td><td></td></tr><tr><td>22 G Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon</td><td>2405</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher</td><td>H19</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

היכולת להעריך היסטולוגיה של ריאות היא קריטית לתחומי חקר סרטן ריאות וגרורות סרטן. חשוב באותה מידה לבצע necropsies במהירות וביעילות ממחקרים מבלי להקריב את איכות הרקמות שנרכשו. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה להחדיר במהירות, לנפח ולתקן ריאות עכבר לניתוח היסטולוגי במורד הזרם. שיטה זו אינה מתקן את אינפלציית הריאות; לכן, זה לא דורש כל נהלים מיוחדים או ציוד ובמקום זאת פשוט מחדיר קיבוע ישירות דרך קנה הנשימה בעקבות זלוף דרך הלב. זה מאפשר הערכה מספקת של גודל הגידול, היסטולוגיה, וניקוד. זה גם מאפשר איסוף של רקמה קפואה לפני קיבוע רקמת הריאה. שיטה זו מוגבלת בכך שהיא אינה מאפשרת כימות מורפומטרי מאוחר יותר של הריאה; עם זאת, זה יותר ממספיק לניתוח גידול ריאות ממודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), מודלים סינגניים, כמו גם גידול קסנוגרפט ומחקרי גרורות.

הפרוטוקול לעיל מאפשר זלוף מהיר, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר. הנתונים המוצגים להלן מייצגים את החשיבות של כל שלב. איור 1 מתאר ריאות מוכתמות H&E שהודבקו ל-PBS ולריאות שבהן דילגו על שלב הזלוף או שהריאות לא הצליחו לחלחל כראוי. כפי שמוצג, עודף דם בריאות perfused גרוע יוצר פחות היסטולוג...

Watch this Scientific Journal Video about Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology at JoVE.com

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.

זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

perfusion-and-inflation-of-the-mouse-lung-for-tumor-histology

Research

JoVE Journal

Cancer Research

18.3K Views.  University of Alabama at Birmingham. מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.

Video: Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

18F-FDG PET/CT הדמיה וחומר היסטולוגיה כמותית למדוד שינויים דינמיים במטבוליזם הגלוקוז במודלים של העכבר של סרטן ריאות

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Medicine

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

Internal lung surface area (ISA) is a critical criterion for assessing lung morphology and physiology in lung diseases and injury-induced alveolar regeneration. We describe here a standardized method that can minimize the measurement bias for ISA in both lung pneumonectomy and prosthesis implantation mouse models.

שיטה מתוקננת למדידת שטח הפנים של הריאות הפנימיות באמצעות דלקת ריאות של עכבר והשתלת תותב

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

Developmental Biology

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

אוויר-אינפלציה של ריאות מורין עם זילוף וסקולרי-קיבוע

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>ניטור בזמן אמת של דינמיקה תאית בהשתלת ריאות עכבר

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום אימונולוגיה של השתלות ריאה באמצעות הדמיה תוך חיונית

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

¹⁸F-FDG PET/CT הדמיה וחומר היסטולוגיה כמותית למדוד שינויים דינמיים במטבוליזם הגלוקוז במודלים של העכבר של סרטן ריאות

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב

שיטה מתוקננת למדידת שטח הפנים של הריאות הפנימיות באמצעות דלקת ריאות של עכבר והשתלת תותב

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

אוויר-אינפלציה של ריאות מורין עם זילוף וסקולרי-קיבוע

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל