הפרוטוקול הבא מתאר מערכת שעובדת היטב בעכברים גרם 20-35. השיטה יכולה בקלות להיות להתאמה לעכברים גדולים יותר או קטנים יותר פשוט על ידי שינוי גודל קטטר. כל פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס הטיפול ושימוש. 1. ריאות החדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צינורית מסחרית אינץ &#39;אחד ארוכת 20 גרם תוך ורידי לשימוש עבור אינטובציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את קצה צנתר כיפוף ידני בו כדי ליצור עקמומיות קלה בקצה כפי שמודגם באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (15 מ&quot;ג / קילוגרם) שהוחדר IP, ולאשר הרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס. החל משחה וטרינרים בעיניים מייד לאחר הרדמה. מייד לאחר ההרדמה להחיל משחה וטרינרים בעיניים ולתת carprofen (5-10 מ&quot;ג / קילוגרם SQ) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח והחדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את mouפרקדן se על פלטפורמה משופעת. כפי שניתן לראות באיור 2, קלסר המשרדי גדול עם לולאות תפר הדביק על עבודות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את החלק הגחוני של הצוואר ולנקות ולחטא את אזור הצוואר עם אלכוהול 70%. עם כפפות חופשיות latex- והפודרה חדשות, להשתמש במכשירי ניתוח לחטא עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים חדים לעשות חתך ניתוחי קטן בצוואר כ -12 מ&quot;מ מתחת לשן החותכת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים משוך בעדינות את העור בצוואר caudally עד קיר הגחון של קנה הנשימה שניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחזור בי הלשון ולהכניס את הצינורית עם הקצה המכופף המוטה לכיוון פני השטח הגחון של העכבר. כמו ב1.4, למשוך בעדינות על העור בצוואר, והכנס את הצינורית לקנה הנשימה. הערה: עם קצת תרגול, קטטר תהיה גלויה נעה כלפי מטה את קנה הנשימה. אם זה הולך בוושט, אז לא תהיה תצפית חזותית של התנועה של קטטר. אין חתכיםנעשים בקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהצנתר ראה בקנה הנשימה בצוואר, מתקדם זה כ -5 מ&quot;מ להיות מהימן עבר מיתרי קול, אבל עדיין הרבה מעל קארינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להנחיל עד 50 μl של נוזל על ידי הזרקה באמצעות הצנתר עם קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל. הנח את הקצה ברכזת luer, אבל לפני הזרקת מבט זהירות להתבונן תנועה של הנוזל בקצה סינכרוני עם הנשימה של העכבר. אז להזריק instillate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק 1 מיליליטר, לעשות מייד אינפלציה מהירה יחסית של 0.6 מיליליטר של אוויר לריאות דרך קטטר כדי לעזור להפיץ עמוק נוזל לריאות. הסר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמות קטנה של דבק cyanoacrylate כדי לסגור את פצע הניתוח הקטן לפי הוראות עלון לVetBond. מניחים עכברים בכלובים בודדים וחזותיים לפקח עליהם עד שהם מתעוררים ומתנהגים כרגיל ללא כל אינדיקציה discomfאורט. </li></ol> 2. ריאות קיבוע הערה: לאחר שכל הליכי הניסוי נעשים בעכבר, ניתן הכינו הריאות לעיבוד היסטולוגית על ידי קיבוע עם פורמלדהיד (או כל מקבע רצוי אחרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר עם הליך מקובל IACUC. לעכבר הנציג מוצג בסרטון, משמש נקע בצוואר הרחם של עכבר הרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הנשמה (אם לא עשה) על ידי ניתוח חושף את הצד הגחוני של קנה הנשימה, מה שהופך אותו חתך קטן, והחדרת קצה מחט בדל 18 G לתוך קנה הנשימה, ולקשור אותו עם חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את בית החזה עם חתך קו האמצע, לחתוך את הסרעפת, ולהסיר את קירות חזה לרוחב כדי לחשוף את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את קצה luer של המחט למאגר על דוכן טבעת המכיל פורמלדהיד. ראה איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשטח העליון של פורמלדהיד 25 סנטימטרים מעל לרמה של mouSE. ראה איור 3. הבא לוודא שאין אוויר בצינור הקיבעון על ידי הפעלת נוזל החוצה סוף ברזלים. חבר את קצה luer של הצינורית לקנה הנשימה לצינורות המאגר. פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לקשור את קנה הנשימה מעבר לקצה של מחט הבדל. זה עשוי לעזור למשוך בחזרה לאט על המחט לחשוף יותר של קנה הנשימה uncannulated. כשקשור באופן מאובטח, להסיר את ברזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הריאות בפורמלדהיד הלילה. פעמים יותר בסדר, וכמה כתמים או לנהלים עלולים לציין שעות מסוימות. כמו כן כל fixatives נוזל אחר, כגון Z-תיקון יכול לשמש להחדרה והטבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עיבוד היסטולוגית נוסף, למדודקבוע הריאה כפי שתואר הבא הנפח. </li></ol> 3. מדידה של נפח הריאות הקבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את השימוש בעיקרון ארכימדס כפי שמודגם באיור 4 נפח הריאות. הסר את הריאות קבועות מפורמלדהיד ולנתח את הלב ואת כל רקמה הלא-ריאה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכשיר שנבנה בעבר פשוט תוצרת בית תמיכת תיל המשמש כדי לשמור על הריאות מתחת למים באופן מלא. הערה: מכשיר זה צריך להיעשות בקנה אחד עם לפי המאזן נמצא בשימוש. מכשיר טיפוסי מוצג באיור 5 עשוי מהפלסטיק וטפטפות חוט הדק (20 G). מערכת זו פועלת היטב עם האיזון בשימוש בוידאו, אבל יכולה בקלות להיות מותאמת למרבית מאזני המעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס עם ≈200 מיליליטר של מים על האיזון וטרה עם הכלוב תומך במקום במים. ראה איור 6 הסר את כלוב המתכת.; למקם את הריאות על פני המים ולחצו מתחת למיםעם הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המשקל על היתרה. מספר זה משקף את נפח מים שנעקרו ולכן מדידה ישירה של נפח הריאות. להיות זהיר כדי לוודא ריאות או תפר או בכל חלק של כלוב התיל לא נוגע בצדדים או בתחתית של הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדיוק, לחזור על מדידה זו. הסר את הריאות מהמים, ויבשות ברקמה. הטרה הכוס עם כלוב במקום שוב ולחזור על מדידת נפח ריאות. שתי מדידות הנפח אמורים להיות בממוצע. הערה: אם הריאות נשארות בפורמלין ליותר משבוע על, האוויר לריאות יפורק בנוזל. כאשר זה קורה, הריאות ישקעו, כך שזה כבר לא צורך להשתמש בכל מכשיר כמו באיור 5 כדי לשמור על הריאות שקועות. במקרה כזה הנפח ניתן למדוד על ידי פשוט על ידי לחיצה על הריאות על ידי אחד ממייתרי התפר עד שהוא שקוע לחלוטין כפי שמודגם באיור 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice.">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li><li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice.">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li><li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice.">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice.">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li><li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies.">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li><li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice.">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li><li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice.">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li><li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Laryngoscopy+in+Mice.">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li><li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).</li><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li><li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives.">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).</li><li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice.">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li></ol>

יש הנהלים שתוארו כאן יש מספר יתרונות. ראשון הציוד הנדרש הוא פשוט וזול. שנית, אינטובציה יכולה להיעשות במהירות עם כמה טעויות. שלישית, את היכולת לתקן את הריאות בלחץ מתמיד, ולאחר מכן למדוד את נפח ריאות הקבוע מאפשרת כימות נכונה של מבנים או תאים בריאה 10. <p class="jove_content" ...

למספר הסיבות, סרטן הריאות לא נחקר באופן נרחב בעכבר. אחת סיבות לכך היא שגישה לריאות קשה מאוד in vivo, וניתוח כמותי של ריאות קבועים לא נעשה בדרך כלל. השיטות שתוארו במאמר זה נועדו לתקן את המצב. המטרות הן מסמך לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. למרות שאף אחד של גישות אלה הם חדשים לגמרי, הם לא הוצגו יחד כשיטות עצמאיות באופן פשוטים כפי שמתואר כאן. יש כבר מספר כתבי היד שתארו שיטות לאינטובציה של ריאות העכבר בעיקר לצורך עושה תפקוד הריאתי חוזר או שטיפה ברונכואלוואולרית בעכברים בודדים במחקרים ארוכי טווח. מאז שנייר מקורי, היו כמה עיתונים אחרים שתארו גישות שונות לmousאינטובציה דואר 1 -9. בעוד שכל אחת מהשיטות הללו יכולים לשמש בהצלחה, הם בדרך כלל דורשים הכשרה רבה, ולעתים קרובות הם לא בלי שיעור כישלון טריוויאלי. בנוסף, על מנת לבצע מדידות תפקוד הריאתי, הצינורית צריכה להתאים את קנה הנשימה חזק מספיק כך שאין דליפת אוויר. עם זאת, עוד שימוש מעשי לאינטובציה הוא לספק סוכנים ספציפיים (תאים סרטניים או עלבונות אחרים) או תרופות טיפוליות ישירות לריאות. הליך כזה אינו דורש צינורית הולמת הדוקה ולא כל ציוד תפקוד הריאתי מתוחכם. התכונה החדשנית של שיטה זו המוצגת כאן כרוכה הליך כירורגי קטין שמאפשר אינטובציה, ללא כל אפשרות של צינורית הזנת הוושט. גישה פשוטה זו מאפשרת אינטובציה מוצלחת עם הכשרה או ניסיון מועט יחסית. כ -30 עכברים / שעה ניתן לטפל באמצעות גישה זו עם שיעור כישלון מתקרב לאפס. ברגע שלאהוא העכברים מוכנים להקריב, הריאות נפצעו או סרטניים אז יכולות להיות הוסרו להיסטולוגית וניתוח פתולוגי. עם זאת, על מנת לכמת כראוי כל משתנים היסטולוגית להשוואה עם ריאות אחרות, זה חיוני כדי לתקנן את נהלי הקיבעון ולכמת את נפח ריאות הקבוע 10 כראוי. מאמר זה מתאר בפירוט את הנהלים הפשוטים שיאפשר נהלי קיבעון סטנדרטיים, כמו גם דרך למדוד קבוע נפח הריאות. הנפח הוא מדד חיוני בכימות של היסטולוגיה, שכן ללא קביעה כאמור נפח, ניתן למדוד רק צפיפות היחסית 10. ברגע שנפח הריאות ידוע, עם זאת, מדידות מוחלטות של תאים ומדידות מבניות אחרות בריאות אז יכולות להיות לכימות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory Balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Adventurer Pro Model AV 313&#160;</td>
			<td>Other balances can be used if they have a range of 1 - 300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 g Luer intravenous catheter</td>
			<td>Insylte</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL laboratory bottle</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research

היכולת להחדיר סוכנים חיים, תאים, או כימיקלים ישירות לתוך הריאות מבלי לפגוע או להרוג את העכברים היא כלי חשוב בחקר סרטן הריאה. אמנם יש מספר השיטות שפורסמו מראים כיצד לצנתר את העכברים למדידות תפקוד הריאתי, אף אחד מהם ללא בעיות פוטנציאליות להחדרה לקנה הנשימה מהירה בקבוצות גדולות של עכברים. בעבודה הנוכחית, שיטה פשוטה ומהירה מתוארת המאפשרת חוקר לבצע instillations כזה בצורה יעילה. השיטה אינה דורשת כל כלים או תאורה מיוחדים וניתן ללמוד עם תרגול מעט מאוד. היא כרוכה בהרדמת עכבר, ביצוע חתך קטן בצוואר כדי להמחיש את קנה הנשימה, ולאחר מכן החדרת צנתר לוריד ישירות. החתך הקטן סגור במהירות עם דבק רקמות, והעכברים אפשרו להתאושש. סטודנט או טכנאי מיומן יכול לעשות instillations בשיעור ממוצע של 2 דקות / עכבר. ברגע שלאהוא הסרטן שהוקם, יש לעתים קרובות צורך בניתוח הכמותי היסטולוגית של הריאות. באופן מסורתי פתולוגים בדרך כלל לא טורח לתקן אינפלציה ריאות במהלך קיבעון, וניתוחים מבוססים לעתים קרובות על שיטת ניקוד שיכול להיות די סובייקטיבי. אמנם זה עשוי להיות מתישהו מספיק הולם לאומדנים גולמי של הגודל של גידול ריאה, כל כימות stereological נכון של מבנה ריאות או תאים דורש הליך קיבעון לשחזור ומדידת נפח ריאות שלאחר מכן. כאן אנו מתארים נהלים אמינות פשוטים עבור שני תיקון הריאות תחת לחץ ולאחר מכן מדידה מדויקת הקבוע נפח הריאות. הדרישה היחידה היא משקל למעבדה כי הוא מדויק על פני טווח של G-300 מ&quot;ג 1. הנהלים שהוצגו כאן ובכך יכולים לשפר באופן משמעותי את היכולת ליצור, לטפל, ולנתח סרטן הריאות בעכברים.

ההליך לתאר בפרוטוקול הראשון אינו בעצמו הביא לשום תוצאות כלליות. זה רק מתאר אמצעי אמין מאוד להחדיר חומרים ישירות לקנה הנשימה. איור 7 מציג דוגמא של ריאות בי trypan הכחול הוחדרה עם השיטה המתוארת כאן. יש הפצה נרחבת של הצבע, דומה למה שכבר ראה עם צבעים אחרים או קליעים נ...

Watch this Scientific Journal Video about Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research at JoVE.com

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. אנו מציגים 3 פרוטוקולים פשוט ואמין לביצוע instillations ריאות, קיבעון, ומדידות נפח ריאות.

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

instillation-and-fixation-methods-useful-in-mouse-lung-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

28.0K Views.  Johns Hopkins University.  המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. אנו מציגים 3 פרוטוקולים פשוט ואמין לביצוע instillations ריאות, קיבעון, ומדידות נפח ריאות. 

Video: Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

פולשנית Intratracheal אינטובציה ללמוד פתולוגיה והפיזיולוגיה של עכבר ריאות

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

אולטראסאונד הדמיה לאבחון של תפקוד העכבר דיאפרגמה

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as models of pulmonary disease often resemble the situation of the human lung much better than mice do. Working with large animals also offers the opportunity to sample the same animal repeatedly over a certain course of time, which allows long-term studies without sacrificing the animals.
The aim was to establish in vivo sampling methods for the use in a bovine model of a respiratory Chlamydia psittaci infection. Sampling should be performed at various time points in each animal during the study, and the samples should be suitable to study the host response, as well as the pathogen under experimental conditions.
Bronchoscopy is a valuable diagnostic tool in human and veterinary medicine. It is a safe and minimally invasive procedure. This article describes the intrabronchial inoculation of calves as well as sampling methods for the lower respiratory tract. Videoendoscopic, intrabronchial inoculation leads to very consistent clinical and pathological findings in all inoculated animals and is, therefore, well-suited for use in models of infectious lung disease. The sampling methods described are bronchoalveolar lavage, bronchial brushing and transbronchial lung biopsy. All of these are valuable diagnostic tools in human medicine and could be adapted for experimental purposes to calves aged 6-8 weeks. The samples obtained were suitable for both pathogen detection and characterization of the severity of lung inflammation in the host.

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

This article describes bronchoscopic techniques in the bovine lung under experimental conditions, i.e. bronchoscopically guided inoculation, bronchoalveolar lavage, bronchial brushing, and transbronchial lung biopsy.

ברונכוסקופיה מודרכת מבחינה ויזואלית, Intrabronchial הרכבת חיסון ו: ריאות שור במחקר ביו<em&gt; בVivo</em&gt; טכניקות דגימה

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

המדידה האקוקרדיוגרפית של פרמטרים של הימני החדרית בעכבר

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...