המתודולוגיה הפשוטה והמעשית שלנו יכולה לשמש כדי להשיג ADSCS בשפע לחקר ADIPogenesis PVAT במבחנה ולמבחן תרופות נורמליות נגד השמנת יתר ומחלות לב וכלי דם הקשורות. היתרון של שיטה זו הוא הפלואורסצנטיות הטבועה של NCADSCs של ביוטין אתה צריך לתייג את התאים עם נוגדנים נדדים flou-chrome עבור FACS, או מיון תאים מופעל מגנטי. שיטה זו יכולה לשמש כדי לרכוש ADSC בשפע נגזר תאי סמל עצבי מן ectoderm ללמוד אדיפוגנזה PVAT, או lipogenesis במבחנה.
באמצעות עכברים צעירים שיש ניסיון עם cautery ו adipogenesis המושרה אומר 3T3 תאים הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה. הדגמת ההליך תהיה Yiding Qi, סטודנטית לתואר שני, וליאן שו, טכנאית מהמעבדה שלי. עבור ניתוח PAAT, לאחר עיקור פגר העכבר ב 75% אתנול במשך חמש דקות, להשתמש במספריים כדי לחשוף ולהפריד את העור על הבטן.
חותכים לאורך קו האמצע הגחון מהאגן לצוואר, ולפתוח את הבטן. להזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת, לחתוך את הסרעפת ואת הצלעות משני צידי קו האמצע. מקלפים בחזרה את הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.
ולהסיר את הריאות ואת התימוס. מוציאים את הפאאט יחד עם בית הישבן והלב לתוך צלחת פטרי. ולנתק את בית ההיתוך בשורש בית ההיתוך כדי להסיר את הלב.
לאחר מכן, לעשות חתך בין קשת בית ההיתוך ו aorta יורד. בזהירות להפריד את רקמת השומן המקיפה את שני המבנים, ואת העורקים הראשיים הנפוצים שמאלה ויימין מקיר החזה האחורי. חשוב להפריד את PAAT מהשורש כמו כלי דם גדולים יותר בזהירות, היא נוכחות של תאי קיר כלי הדם יכול להשפיע על יעילות FACS.
מניחים את הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה חיץ HBSS קר כקרח. ולהשתמש מטלטולים סטריליים כדי להסיר כמה שיותר של כלי דם fascia ככל האפשר. לאחר מכן, להעביר את רקמת השומן לתוך צינור Eppendorf שני מיליליטר, המכיל נקודה חמישה מיליליטר של חיץ HBSS קר קרח על קרח.
כאשר כל PAAT נאסף, להעביר את רקמת השומן שנקטפו לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר חדש המכיל מיליליטר אחד של מדיום עיכול מוכן טרי. ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לטחון את הרקמות. העבר את תרחיף הרקמה לתוך צינור 50 מילימטר המכיל תשעה מיליליטר של מדיום עיכול טרי.
ולהשתמש פיפט מיליליטר אחד כדי triturate הרקמות 10 פעמים. כאשר פתרון הומוגני הושג, דגירה הצינור במשך 30 עד 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 100 מהפכות לדקה, בדיקת כל חמש עד 10 דקות כדי למנוע overdigestion. כאשר פתרון רקמת שומן הומוגני צהוב בהיר ניתן לראות על מערבולת עדינה של הצינור, לעצור את העיכול עם חמישה מיליליטר של HDMEM בתוספת 10% נסיוב חזיר עוברי.
לאחר ערבוב יסודי, צנטריפוגה מדגם רקמת השומן. שבר תא כלי הדם הסטרומאלי יהיה גלוי ככדור חום. להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום תרבות, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה אחרת. בעדינות להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ תזה אריתרוציטים. העבר את ההשעיה לצינור 15 מיליליטר.
לאחר 10 דקות, להפסיק את התגובה עם שני צנטריפוגות ב 10 מיליליטר של PBS, בתוספת 1% נסיוב בקר עוברי. לאחר הצנטריפוגה השנייה, להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות על קרח. ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה סופית.
לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מאגר FACS לספירה. כדי להקים תרבות NCADSC, לאחר הבידוד שלהם על ידי FACS על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, למקם את התאים בחמש פעמים 10 לתאים השלישיים לס"מ בריבוע ריכוז בכל באר, צלחת תרבות 12 היטב. בינוני תרבות לא שלם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 20 עד 24 שעות.
למחרת, לשטוף את התאים עם 37 מעלות צלזיוס PBS, ולהאכיל את התרבות עם מדיום תרבות טרי. כאשר התרבות מגיעה 80 עד 90%confluency, לטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לגם במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים נותקו מתחתית הצלחת, לנטרל את האנזימים עם שני מיליליטר של מדיום מתורבת, ולאסוף את התאים שנקטפו על ידי צנטריפוגה.
להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי לספירה. ולזרע את התאים בצלחת חדשה של 12 בארות בתרבות של חמש פעמים עד התאים השלישיים, ריכוז בריבוע של 12 ס"מ. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים הנותרים בתרבות בינוני בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד לאחסון קפוא בחנקן נוזלי.
כדי לגרום התמיינות אדיפוגנית, כאשר התאים מגיעים 80 עד 90%confluency, לטפל בתאים עם מדיום אינדוקציה אדיפוגניים חום או לבן במשך יומיים לפי הצורך. בסוף הדגירה, יש לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS לפני הוספת מדיום אינדוקציה אדיפוגניים טרי מתאים לכל באר, והחזרת התאים לחממת תרבות התאים למשך שלושה עד חמישה ימים נוספים של דגירה. NCADSCs מתורבתים להגיע 80 עד 90% confluency לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבות.
ולהדגים פיברגלס מורחב כמו מורפולוגיה. כדי לאשר עוד יותר את הפוטנציאל האדיפוגני שלהם, כתמים אדומים שמן של NCADSCs הבדיל יכול להתבצע כדי לזהות adipocytes בוגרת. בדרך כלל, adipocytes בוגרת נצפו לאחר שמונה ימים של אינדוקציה אדיפוגנית לבנה או חומה עם מעל 60% של NCADSCs המציגים התברמות אדיפוגנית.
שים לב כי NCADSCs להפגין פוטנציאל אדיפוגני מופחת מאוד לאחר המעבר. Immunoblotting ו PCR כמותי בזמן אמת לגלות כי הביטוי של חלבונים יחסיים ספציפיים adipocyte וגנים גדל באופן משמעותי NCADSCs הבדיל אדיפוגנית לאחר שמונה ימים של אינדוקציה אדיפוגנית לבנה. באופן דומה, הביטוי של גנים ספציפיים adipocyte, וגנים ספציפיים adipocyte חום, גם עולה באופן משמעותי לאחר שמונה ימים של אינדוקציה אדיפוגנית חומה.
מכיוון שרוב פרוטוקול הבידוד של NCADSC הוא פשוט, חסכוני, ולא דורש שימוש בנוגדנים, לשם כך, עוצמת הסיבות הנוזליות החזקות של IFP יכולה לשפר את יעילות ההזנה של FACS.
