Nuestra metodología simple y práctica se puede utilizar para obtener abundante ADSCS para el estudio de la adipogénesis PVAT in vitro y para la prueba de fármacos normales contra la obesidad y enfermedades cardiovasculares relacionadas. La ventaja de este método es la fluorescencia inherente de los NCADSC de biotina que necesita para etiquetar las células con anticuerpos conjugados de cromo flou para FACS, o clasificación de células activadas magnéticas. Este método se puede utilizar para adquirir abundante ADSC derivado de las células de la cresta neural del ectodermo para estudiar la adipogénesis PVAT, o lipogénesis in vitro.
El uso de ratones jóvenes y tener experiencia con cautesis e adipogénesis inducida significa que las células 3T3 son fundamentales para el éxito de este protocolo. Demostrando el procedimiento estarán Yiding Qi, un estudiante de posgrado, y Lian Xu, un técnico de mi laboratorio. Para la disección PAAT, después de esterilizar la carcasa del ratón en 75%etanol durante cinco minutos, use tijeras para cortar y separar la piel en el abdomen.
Corte a lo largo de la línea media ventral desde la pelvis hasta el cuello, y abra el abdomen. Mueva el hígado para exponer el diafragma y corte el diafragma y las costillas a ambos lados de la línea media. Pelar hacia atrás las costillas para exponer el corazón y los pulmones.
Y quita los pulmones y el timo. Extraiga el PAAT junto con la aorta y el corazón en un plato de petri. Y corta la aorta en la raíz aórtica para eliminar el corazón.
Luego, haz un corte entre el arco aórtico y la aorta descendente. Separe cuidadosamente el tejido adiposo que rodea ambas estructuras, y las arterias carótidas comunes izquierda y derecha de la pared torácica posterior. Es importante separar el PAAT de la raíz y como un vaso vascular más grande cuidadosamente, es la presencia de células de pared vascular puede afectar la eficiencia de FACS.
Coloque el tejido en una placa de petri que contenga un tampón HBSS helado. Y usa fórceps estériles para eliminar la mayor cantidad posible de vasculatura y fascia. A continuación, transfiera el tejido adiposo a un tubo Eppendorf de dos mililitros, que contiene cinco mililitros de tamampón HBSS helado sobre hielo.
Una vez recogido todo el PAAT, transfiera el tejido adiposo cosechado a un nuevo tubo de micro centrífuga de dos mililitros que contenga un mililitro de medio de digestión recién preparado. Y usa tijeras quirúrgicas para picar los tejidos. Transfiera la suspensión tisular a un tubo de 50 milímetros que contenga nueve mililitros de medio de digestión fresca.
Y usa una pipeta de un mililitro para triturar los tejidos 10 veces. Cuando se haya obtenido una solución homogénea, incuba el tubo durante 30 a 45 minutos a 37 grados centígrados y 100 revoluciones por minuto, comprobando cada cinco a 10 minutos para evitar la sobredigestión. Cuando se pueda observar una solución de tejido adiposo homogénea de color amarillo claro al agitar suavemente el tubo, detenga la digestión con cinco mililitros de HDMEM complementados con un 10% de suero bovino fetal.
Después de una mezcla exhaustiva, centrifugar la muestra de tejido adiposo. La fracción de célula vascular estromal será visible como un pellet pardón. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo y filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros.
Recoger las células por otra centrifugación. Y re-suspende suavemente el pellet en cinco mililitros de tórculo de eritrocitos tampón de lysis. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros.
Después de 10 minutos, detener la reacción con dos centrifugaciones en 10 mililitros de PBS, complementado con 1%de suero bovino fetal. Después de la segunda centrifugación, re-suspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo sobre hielo. Y recoger las células con una centrifugación final.
Entonces, vuelva a suspender las células en cinco mililitros del buffer FACS para contar. Para configurar un cultivo NCADSC, después de su aislamiento por FACS de acuerdo con los protocolos estándar, coloque las células en cinco veces 10 a las terceras celdas por centímetros de concentración cuadrada en cada pozo, una placa de cultivo de doce pozos. Medio de cultivo incompleto a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante 20 a 24 horas.
Al día siguiente, lave las células con 37 grados Celsius PBS, y alimente el cultivo con medio de cultivo fresco. Cuando el cultivo alcance entre el 80 y el 90% de confluencia, trate las células con dos mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por pozo durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se han separado de la parte inferior de la placa, neutralizar las enzimas con dos mililitros de medio cultivado, y recoger las células cosechadas por centrifugación.
Re-suspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo fresco para el conteo. Y sembrar las células en una nueva placa de cultivo de 12 pozos en una concentración de cinco veces 10 a las terceras celdas por centímetros al cuadrado. Luego, re-suspenda las células restantes en medio de cultivo complementado con 10%dimetil sulfóxido para el almacenamiento congelado en nitrógeno líquido.
Para inducir la diferenciación adipogénica, cuando las células alcanzan una confluencia del 80 al 90%, trate las células con medio de inducción adipogénico marrón o blanco durante dos días según corresponda. Al final de la incubación, lave suavemente las células dos veces con PBS antes de agregar el medio de inducción adipogénico fresco apropiado a cada pocóptil, y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante tres a cinco días adicionales de incubación. Los NCADSC cultivados alcanzan una confluencia de 80 a 90% después de siete a ocho días de cultura.
Y demostrar una fibra de vidrio expandida como morfología. Para confirmar aún más su potencial adipogénico, se puede realizar la tinción roja de aceite de los NCADSC diferenciados para detectar adipocitos maduros. Típicamente, los adipocitos maduros se observan después de ocho días de inducción adipogénica blanca o marrón con más del 60% de los NCADSC que presentan diferenciación adipogénica.
Tenga en cuenta que los NCADSC demuestran un potencial adipogénico muy reducido después de la translación. La inmunoblotting y la PCR cuantitativa cuantitativa en tiempo real revelan que la expresión de proteínas y genes relativos específicos de adipocitos aumenta significativamente en NCADSC diferenciados adipogénicamente después de ocho días de inducción adipogénica blanca. Del mismo modo, la expresión de genes específicos de adipocitos, y genes específicos de adipocitos marrones, también aumenta significativamente después de ocho días de inducción adipogénica marrón.
Dado que la mayoría del protocolo de aislamiento NCADSC es simple, económico y no requiere el uso de anticuerpos, por lo que la fuerte intensidad fluida de IFP puede mejorar la eficiencia de nutrición de FACS.
