神经冠状原脂肪衍生干细胞的分离、培养和异位诱导，来自围阴脂肪组织

我们简单实用的方法可用于获得丰富的ADSCS研究PVAT体外脂肪发生，并测试正常药物对抗肥胖和相关心血管疾病。此方法的优点是生物素的 NCADSC 的固有荧光，您需要为细胞贴上用于 FACS 的 flou-铬结合抗体的标签，或磁激活细胞分选。该方法可用于从外皮细胞中获得丰富的ADSC，用于研究PVAT脂肪生成，或体外光生成。

使用年轻的小鼠和有烧灼和诱导性致病的经验意味着3T3细胞是成功的关键，该协议的成功。演示这个程序的将是研究生齐一丁和我实验室的技术员徐连。对于PAAT解剖，在用75%乙醇对小鼠尸体进行消毒5分钟后，使用剪刀剪断腹部的皮肤并分离。

沿着从骨盆到颈部的腹中线切开，然后打开腹部。移动肝脏以暴露膜片，并切割中线两侧的隔膜和肋骨。剥回肋骨，露出心肺。

取出肺和胸腺。将 PAAT 与大菜和心脏一起提取到培养皿中。切断大音管的母管根切掉心脏。

然后，在大音和下降大音之间做一个切口。小心地将两个结构周围的脂肪组织以及左右常见的角状动脉与后胸壁分开。重要的是要将PAAT与根部分离，并且作为一个更大的血管血管，血管壁细胞的存在会影响FACS的效率。

将组织放入含有冰冷HSS缓冲液的培养皿中。并使用无菌钳子去除尽可能多的血管和筋膜。然后，将脂肪组织转移到两毫升Eppendorf管中，在冰上含有5毫升的冰冷HSS缓冲液。

当所有PAAT被收集后，将收获的脂肪组织转移到一个新的两毫升微离心管中，其中包含一毫升新鲜准备的消化介质。用手术剪刀把组织切碎。将组织浆料转移到含有9毫升新鲜消化介质的50毫米管中。

并使用一毫升移液器对组织进行10次三角化。获得均匀溶液后，在37摄氏度下孵育管30至45分钟，每分钟100转，每5至10分钟检查一次，以防止过度消化不良。当一个浅黄色同质脂肪组织溶液可以观察到在轻轻的旋转管，停止消化与5毫升HDMEM辅以10%胎儿牛血清。

经过彻底混合后，将脂肪组织样品离心。频闪血管细胞分数将可见为棕色颗粒。将颗粒重新悬浮在培养培养的10毫升中，并通过70微米细胞滤株过滤细胞悬浮液。

通过另一个离心收集细胞。轻轻将颗粒重新悬浮在五毫升红细胞解液缓冲液中。将悬浮液转移到 15 毫升管中。

10分钟后，在10毫升PBS中用两个离心停止反应，并辅以1%的胎儿牛血清。第二次离心后，将颗粒重新悬浮在五毫升培养培养剂的冰上。并收集细胞与最后的离心。

然后，将细胞重新挂起在五毫升的 FACS 缓冲液中进行计数。为了建立一个NCADSC培养物，在按照标准协议被FACS隔离后，将细胞放在每厘米平方浓度的5倍至第三细胞，一个12个井培养板。不完全的培养基在37摄氏度和5%的二氧化碳20至24小时。

第二天，用37摄氏度的PBS清洗细胞，用新鲜的培养媒介喂养细胞。当培养达到80至90%的汇合时，用每井0.25%的两毫升二毫升处理细胞，在37摄氏度下治疗3至5分钟。当细胞从板底分离时，用两毫升培养基中和酶，通过离心收集收获的细胞。

将颗粒重新悬浮在一毫升新鲜培养介质中进行计数。并在新的12井培养板中播种细胞，每厘米浓度为5倍至3个细胞。然后，重新悬浮培养基中剩余的细胞，并辅以10%二甲基硫化物，冷冻储存在液氮中。

为了诱导致原性分化，当细胞达到80-90%的汇合时，酌情用棕色或白色致原诱导介质治疗细胞两天。在孵化结束时，用PBS轻轻清洗细胞两次，然后向每个井中加入适当的新鲜致生诱导培养基，将细胞返回到细胞培养箱中再进行三到五天的孵化。养殖的 NCADSC 在培养七到八天后达到 80% 到 90% 的汇合率。

并演示一种膨胀的玻璃纤维，如形态学。为了进一步确认其致病性潜力，可以对分化的NCADSC进行油红色染色，以检测成熟的脂肪细胞。通常，在8天的白色或棕色致原诱导后观察到成熟的脂肪细胞，超过60%的NCADSC表现出致发性分化。

请注意，NCADSC 在传传后表现出大大降低的致生潜力。免疫印迹和定量实时PCR显示，在8天的白色脂肪诱导后，脂肪细胞特异性相关蛋白质和基因的表达在脂肪分化的NCADSC中显著增加。同样，在八天棕色脂肪诱导后，脂肪细胞特异性基因和棕色脂肪细胞特异性基因的表达也显著增加。

由于大多数NCADSC分离协议简单、经济，不需要使用抗体，因此，IFP的强流体原因强度可以提高FACS的营养效率。