Basit ve pratik metodolojimiz, PVAT adipogenezinin in vitro olarak incelenmesi ve obezite ve buna bağlı kardiyovasküler hastalıklara karşı normal ilaçların test edilmesi için bol miktarda ADSCS elde etmek için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı, biotin NCADSCs doğal floresan si FACS veya manyetik aktif hücre sıralama için flou-krom konjuge antikorlar ile hücreleri etiketlemek gerekir. Bu yöntem pvat adipogenezi veya lipogenez in vitro incelemek için ektoderm nöral krest hücrelerinden elde edilen bol ADSC elde etmek için kullanılabilir.
Genç farelerin kullanılması ve kedotery ve indüklenen adipogenez deneyimine sahip olmak, 3T3 hücrelerinin bu protokolün başarısı için çok önemli olduğu anlamına gelir. Prosedürü gösteren Yiding Qi, bir yüksek lisans öğrencisi ve Lian Xu, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. PAAT diseksiyonu için, fare leşini beş dakika boyunca %75 etanolle sterilize ettikten sonra, karnındaki deriyi ayırmak ve ayırmak için makas kullanın.
Leğen kemiğinden boyuna kadar ventral orta hat boyunca kesin ve karın açın. Diyafram ortaya çıkarmak için karaciğer hareket ettirin, ve orta hattın her iki tarafında diyafram ve kaburga kesti. Kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için kaburgaları soyun.
Akciğerleri ve timusu da çıkar. Bir petri kabıiçine aort ve kalp ile birlikte PAAT ayıklayın. Ve kalbi çıkarmak için aort kökündeki aortu kesin.
Sonra, aort kemer ve alçalan aort arasında bir kesim yapmak. Dikkatle her iki yapıçevreleyen yağ dokusu ayırmak, ve arka göğüs duvarından sol ve sağ ortak karotis arterler. Bu kökten PAAT ayırmak için önemlidir ve daha büyük bir vasküler damarlar dikkatle olarak, vasküler duvar hücrelerinin varlığı FACS verimliliğini etkileyebilir.
Buz soğuk HBSS tampon içeren bir petri kabına doku yerleştirin. Ve mümkün olduğunca vaskülatür ve fasya kadar kaldırmak için steril forceps kullanın. Daha sonra, iki mililitre Eppendorf tüp içine yağ dokusu aktarın, buz üzerinde buz soğuk HBSS tampon noktası beş mililitre içeren.
Tüm PAAT toplandığında, hasat edilen yağ dokusunu bir mililitre taze hazırlanmış sindirim ortamı içeren yeni bir iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ve dokuları kıymak için cerrahi makas kullanın. Doku bulamacını dokuz mililitre taze sindirim ortamı içeren 50 milimetrelik bir tüpe aktarın.
Ve dokuları 10 kez triturate için bir mililitrelik pipet kullanın. Homojen bir solüsyon elde edildiğinde, tüpü 30 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve dakikada 100 devirde kuluçkaya yatırın ve aşırı hazımsızlığı önlemek için her 5 ila 10 dakikada bir kontrol edin. Açık sarı homojen bir yağ dokusu çözeltisi tüpün hafif girdap üzerine gözlenebilir zaman, HDMEM beş mililitre ile sindirimi durdurmak 10% fetal sığır serum uymaktadır.
Iyice karıştırıldıktan sonra, yağ dokusu örneğini santrifüj edin. Stromal vasküler hücre fraksiyonu kahverengimsi bir pelet olarak görünür olacaktır. Peleti 10 mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik bir süzgeçten filtre uygulayın.
Başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak. Ve yavaşça eritrositler lysis tampon beş mililitre pelet yeniden askıya. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
10 dakika sonra, PBS 10 mililitre iki santrifüjler ile reaksiyonu durdurmak, 1% fetal sığır serumu ile takviye. İkinci santrifüjden sonra, buzun üzerinde beş mililitre lik kültür ortamı içinde peleti yeniden askıya alın. Ve hücreleri son bir santrifüjle toplayın.
Daha sonra, saymak için FACS arabelleği beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Bir NCADSC kültürü kurmak için, standart protokollere göre FACS tarafından izolasyon sonra, her bir kuyu, on iki kuyu kültür plakası santimetre kare konsantrasyonu için üçüncü hücrelere beş kez 10 hücreleri yerleştirin. 37 santigrat derece ve 20 ila 24 saat için% 5 karbondioksit eksik kültür orta.
Ertesi gün, hücreleri 37 santigrat derece PBS ile yıkayın ve taze kültür ortamı ile kültürü besleyin. Kültür %80 ila %90 biraraya geldiğinde, hücreleri 37 santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca her kuyubaşına %0,25 tripsin EDTA'nın iki mililitresiyle tedavi edin. Hücreler plakanın altından ayrıldığında, iki mililitre kültürlü ortam ile enzimleri nötralize edin ve hasat edilen hücreleri santrifüj le toplayın.
Yeniden saymak için taze kültür ortamı bir mililitre pelet askıya. Ve hücreleri yeni bir 12 kuyu kültür plakası içinde beş kez 10 santimetre kare konsantrasyon üçüncü hücrelere tohum. Daha sonra, sıvı azot dondurulmuş depolama için% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenen kültür orta kalan hücreleri yeniden askıya.
Adipojenik farklılaşmayı tetiklemek için, hücreler %80-90 bir araya geldiğinde, hücreleri kahverengi veya beyaz adipojenik indüksiyon ortamıile iki gün boyunca uygun şekilde tedavi edin. Kuluçka sonunda, hücreleri pbs ile iki kez yıkayın ve her kuyuya uygun taze adipojenik indüksiyon ortamını eklemeden ve hücreleri üç ila beş günlük ek kuluçka için hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kültürlü NCADSCs kültür yedi ila sekiz gün sonra% 80-90 bir araya ulaşmak.
Ve morfoloji gibi genişletilmiş bir fiberglas göstermek. Daha fazla adipojenik potansiyelini doğrulamak için, farklılaşmış NCADSCs yağ kırmızı boyama olgun adipositler tespit etmek için yapılabilir. Tipik olarak, olgun adipositler adipojenik farklılaşma gösteren NCADSCs üzerinde% 60 ile beyaz veya kahverengi adipojenik indüksiyon sekiz gün sonra gözlenir.
NCADSC'lerin geçtikten sonra büyük ölçüde azaltılmış bir adipojenik potansiyel gösterdiğini unutmayın. İmmünoblotve kantitatif gerçek zamanlı PCR, sekiz günlük beyaz adipojenik indüksiyondan sonra adipojenik diferansiyek diferansiyek sikanlı NCADSC'lerde adipositspesifik spesifik protein ve genlerin ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını ortaya koymaktadır. Benzer şekilde, adiposit spesifik genlerin ekspresyonu ve kahverengi adiposit spesifik genler de kahverengi adipojenik indüksiyon sekiz gün sonra önemli ölçüde artar.
Çoğu NCADSC izolasyon protokolü basit, ekonomik olduğundan ve antikor kullanımını gerektirmediğinden, ifp'nin güçlü sıvı nedenlerinin yoğunluğu FACS beslenme verimliliğini artırabilir.
