Name: isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר (IZKF) מינסטר הקליני (SEED 12/03, SB), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), תאים-בתנועה האשכול של אקסלנס (1003 EXC - CIM), אוניברסיטת מינסטר (לSB וSGM) ועל ידי קרונה-Fresenius-Stiftung השאר (2012_A88 לSB וSGM). אנו מודים ליקה בלום לאיורים מעולים.

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הרשויות המקומיות (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; רקלינגהאוזן, גרמניה&quot;) ומתנהלים על-פי החוק הגרמני של הגנה על בעלי חיים. 1. הערות כלליות לניסויים בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל הניסויים באמצעות עכברים בהתאם להנחיות הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ותאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים לגיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי בגלל מאפיינים ביולוגיים יכולים להשתנות עם גיל ומין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל שניתן לנסות ולצמצם, לחדד או להחליף ניסויים בבעלי חיים. </li></ol> 2. הכנת שיפוע Percoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 19 מיליליטר של 1x PBS עם 1 מיליליטר 10x PBS, 1 FCS מיליליטר ו -10 מיליליטר Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע STEלהרגיז סינון בצינור זכוכית (קוטר נקבוביות מסנן: 0.2 מיקרומטר). לאחר מכן לאחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. הכנת תא האנדותל בינוני והציפוי של צלחות תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני תא האנדותל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 500 מיליליטר בינוני: (. כ -20%) מערבבים 400 מיליליטר DMEM בינוני (. כ 80%) עם 100 PDS מיליליטר, 0.25 ml bFGF (. 20 מיקרוגרם / מיליליטר; כ 0.05%), 0.5 מיליליטר הפרין (100 μl / מיליליטר;. כ 0.1%) ו -0.5 מיליליטר pyrumycin (4 מ&quot;ג / מיליליטר;. כ 0.1%). להוסיף pyrumycin רק למדיום תרבות תא בשימוש ב2 הימים הראשונים של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סינון סטרילי בתוך שפופרת זכוכית (קוטר נקבוביות מסנן: 0.2 מיקרומטר). לאחר מכן לאחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של צלחות תרבית תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל1 מיליליטר של תמיסת ציפוי, להכין פתרון של DDH 500 μl 2 O, 400 IV μl קולגן (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) ו -100 μl פיברונקטין (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את פני השטח של EAC כלגם שעות של צלחת תרבית תאים עם פתרון הציפוי. אחסן את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol></li></ol> 4. בידוד של תאי האנדותל Murine מוח כלי הדם (MBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב 10 עכברים בוגרים (8-12 שבועות, C57BL / 6) נקע בצוואר רחם. לאחר מכן לבודד את העכבר-המוח וחנות ב 5 מיליליטר של PBS (אזהרה:! עבודה סטרילית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מוח נובע, cerebella וthalami עם מלקחיים. לנתק את קרומי המוח על ידי גלגול בזהירות את מוחם על נייר סופג סטרילית. לאסוף forebrains קרומי המוח-חופשיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח לצינור 50 מיליליטר פלקון המלא 13.5 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה, ראשון עם טפטפת 25 מיליליטר, ולאחר מכן עם פיפטה 10 מיליליטר עד התקשורת הופכת להיות חלבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז לעכל את הרקמה בתערובת של 0.6 collagenase CLS2 מיליליטר (10 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM) ו0.2 מיליליטר DNAse (1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS) בDulbecco של הנשר בינוני (DMEM) השתנה עבור שעה 1 ב 37 ° C על מסלול לנערr ב 180 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של DMEM מתווסף ההשעיה ו צנטריפוגות רקמת התאים XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant בטל (אזהרה:! הגלולה היא קלה לאבד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את המיאלין, resuspend את הכדור עם טפטפת 25 מיליליטר ב -25 מיליליטר של BSA-DMEM (20% w / v) (כ. 25 פעמים), ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה העליונה המיאלין (החלבית) עם פיפטה פסטר זכוכית שבורה בקוטר גדול יותר, ולאחר מכן למחוק את שכבת BSA עם פיפטה פסטר נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב9 מיליליטר DMEM ולהוסיף 1 מיליליטר collagenase / dispase (ריכוז סופי הוא 1 מ&quot;ג / מיליליטר) ו -0.1 מיליליטר DNAse. לעכל את הפתרון עבור שעה 1 ב 37 ° C על שייקר מסלולית ב 180 סל&quot;ד (אזהרה: לא להשתמש בפיפטה resuspend - יכולים ללכת לאיבוד תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך העיכול, צנטריפוגה פתרון Percoll להקים שיפוע הצפיפות באמצעות ultracentrifuge ב3,000 XG עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס, עם ההאצה, wiבלם thout. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של DMEM להשעית התא מתעכלת. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. ואז להשליך את supernatant ו resuspend גלולה ב 2 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תאי resuspended בזהירות על גבי שיפוע Percoll ו צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות ב 4 ° C, ללא האצה ובלימה. הערה: התאים גלויים כענן בשלבי הביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כ. 12 מיליליטר של שלבי ביניים עם תאים בעזרת מחט סטרילית ארוכה ולמקם אותו ב-50 מיליליטר פלקון חדש עם 5 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים שוב XG ב 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן resuspend גלולה במדיום תא האנדותל (השתמש כ. 0.2 מיליליטר של מדיום לסנטימטר 1 2 פני השטח של צלחת תרבית תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון ציפוי מצלחות תרבית תאים מצופים (ראה שלב 3.2) ולשטוף היטב כל עם PBS סטרילי בשני שלבי שטיפה ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרביות תאי אנדותל במדיום סלולארי על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור סטרילי. לשנות את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. פיצול תאים בנקודת מפגש של 90%. </li></ol>

<ol>
	<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology.">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li><li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain;+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development.">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li><li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+(TREK1)+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS.">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li><li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging.">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li><li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li><li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li><li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-to-cell+junctions:+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis.">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+delivery.">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li><li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions.">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier.">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system.">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li><li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crawl,+cross:+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers.">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li><li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation.">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+NKG2D++T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation.">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455 (2013).</li><li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone.">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3,+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4.">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li><li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events.">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li><li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier.">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

תפקוד לקוי של דם למוח-מכשול הוא סימן היכר של מחלות של מערכת העצבים המרכזית מזיקות שונות, למשל פירוט של BBB בטרשת נפוצה באופן נרחב מאפשר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תאי מערכת חיסון אוטוריאקטיבים ומאפשר מפגש והרס של oligodendrocytes. בשבץ איסכמי שיבוש BBB והיווצרות הבאה של בצקת במוח הם גורמים קריטיים המשפיעים על צמיחת אוטם משנית וההישרדות הכוללת של חולים 6. יתר על כן, על ידי שינויים של BBB באזורים מרוחקים נגעים איסכמיים מוקד יכולים לגרום לשינויים פונקציונליים נרחבים של המוח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס הם במידה רבה לא ידועים 5. בניגוד לכך, הצפיפות הגבוהה והמגוון של מובילים בזרימת בBMECs הפונקציונלי מפחיתים את הריכוז של תרופות מועילות כגון chemotherapeutics לממאירויות מוח או אנטיביוטיקה לטיפול במחלות זיהומיות. לכן, הבנה עמוקה יותר של הדם-המוח-ברRier לתפקד בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological נדרש לפתח סוכנים תרופתיים שמסוגלים לווסת באופן ספציפי את תפקוד המחסום בכיוון המועדף 21. אמין במודלים חוץ גופית של BBB הם כלים הכרחיים כדי לחקור את מנגנוני הרגולציה בBBB. שורות תאי אנדותל המוח הונצחו רבות הוקמו והועסקו כבמודלים חוץ גופית BBB 22. שורות תאים אלה מציעים יתרונות מסוימים על פני BMECs העיקרי כפי שהם גדלים מהר יותר ולשמור על מאפייני BBB מסוימים על פני מספר קטעים. עם זאת, שורות תאי אנדותל לא יכולות להחליף באופן מלא לתאים ראשוניים תכונות חשובות כמו משתנות שמתערבבים עם אפשרות ההעברה של ממצאים ניסיוניים למצב in vivo. לדוגמא, שורת תאי אנדותל מוח העכברית bEnd.5 מבטא רמות נמוכות רק של חלבוני צומת הדוקים מופצים discontinuously המוביל לגבוה paracחדירות ellular 23. BEnd.3, עוד שורת תאים המשמשת לעתים קרובות עכברית אנדותל המוח, מדגימה צמתים צפופים ורציפים מופצים הדוקים, התנגדות Transendothelial גבוהה, כמה מובילים בזרימת וחדירות paracellular נמוכות. עם זאת, שכבות תאי bEND.3 לעומת BMECs העיקרי חסרות אפליה של ממש ביחס לחלחול של transcellular מסוים ומצעי paracellular 24. בהכנות של תרביות תאים ראשוניות, תאי זיהום יכולים להפריע באופן משמעותי עם התוקף של ממצאים ניסיוניים. בפרוטוקול המתואר, pyrumicin משמש כסוכן סלקטיבית לתאי אנדותל כדי להשיג טוהר גבוה. עם זאת, בקרת איכות רגילה של תרבית התאים נחוצה באופן בלתי נמנע להבטחת לניסויים אמינות. ישנן מספר שיטות לבקרת איכות, חוץ ממאפיינים טיפוסיים מורפולוגי של תאי האנדותל (ראה איור 1 א &#39;), transendotheliaהתנגדות l עשויה להימדד או הביטוי של סמן תא אנדותל כגון CD31 (ראה איור 1) או גורם פון Willebrand (vWF) עשוי להיות מוערך. מספר תאי אנדותל מוח המבודדים ממוח עכבר אחד הוא יחסית נמוך ולהגדיר את תרבות תאים תקינה לניסויים רבים, מוחם של כמה עכברים צריך להיות ויקווה. מניסיוננו, לפחות 10 עכברים צריכים לשמש לניסוי אחד שעשויה להיות גורם מגביל בהתאם למשאבים של מתקן בעלי החיים בהתאמה. כדי למנוע הטיה או גורמים מבלבלים, עכברים רק עם רקע גנטי וסביבתי זהה יש ייקוו. בניגוד לכך, שור והכנות תא אנדותל המוח חזיריות מספקים מספר רב של תאי האנדותל פנוי במוח במוח אחד. עם זאת, מלבד הרבייה לא מסובכת ודיור, רפרטואר הרחב והולך וגובר של עכברים הטרנסגניים זמינים הופך עכברי העיקרי BMECs כאידאלמודל ללמוד לתפקד דם-המוח-גדר. כמה ממצאים מרכזיים הנוגעים לתפקידי BBB והמנגנונים המולקולריים שבבסיס הגיעו ממחקרים במערכות תרבית רקמת 2D. לאחרונה, מערכות תרבות 3D פותחו 25, שבו תאי אנדותל ממוקמים בתוך מטריצת הקולגן המאפשרת להם ליצור לום ורשתות צינורי. מערכות תרבית תאים החדשות אלה מאפשרים לעוד יותר מדויקים רבייה של תהליכים וכלי דם באורגניזם שלם in vivo. מעורבותם של תאים נוספים של מערכות תרבית תאי NVU ב3D, כגון pericytes והאסטרוציטים עשויה לחולל מהפכה לומדת בתפקוד דם-מוח-מחסום במבחנה; לאחרונה דגמים הראשונים פותחו 26. יש כמה המלצות לפתרון בעיות. קודם כל העבודה סטרילית הוא חיוני לאיכות של תרבית תאי אנדותל. שנית, pyrumycin יש להוסיף רק לתאהתרבות בינונית המשמש ב2 הימים הראשונים של תרבות, יישום עוד עלול להוביל למוות מוגבר MBMEC תא ותפקוד מחסום באיכות נמוכה. שלישית, יש להשתמש באנזימים המיושמים בפרוטוקול זה ומאוחסנים בהתאם להוראות היצרן; אחרת התפקוד התקין שלהם עלול להיות בסכנה. יתר על כן, הציפוי של צלחות תרבית תאים עשוי להיות מתוקן אם תאי האנדותל אינם מייחסים. ריכוזים של פיברונקטין וקולגן עשויים להיות שונה או חלבוני מטריצה ​​אחרים עשויים להתווסף לפתרון הציפוי. לבסוף, גיל, מין, עונה של השנה והתנאים סביבתיים במתקן בעלי החיים הם גורמים חשובים שעשויות להשפיע על איכות בידוד MBMEC וההשוואתיות של ניסויים. יש להבטיח כי תנאים דומים בין ניסויים בלתי תלויים. הפרוטוקול המתואר צריך להיחשב כשיטת neuroimmunological בסיסית לבודד BMECs העכברי. התאים המבודדים יכולים להיות uSED למגוון רחב של יישומים, כדי להעמיק לתוך פונקצית BBB, כגון מבחני הגירה, גן ומחקרי ביטוי חלבון, הערכות אלקטרו או ניסויי חדירות. כאמור לעיל, מערכות תרבית תאי 3D של BMECs עשויות לספק הזדמנויות חדשות לחקור את המנגנונים המורכבים מעורבים בוויסות של BBB בהקשר של NVU. לכן, הבידוד של תאי האנדותל עיקריים יישאר טכניקה לא יסולא בפז בתחום מחקר BBB בעתיד.

<html> monolayers צורת כלי דם במוח בתאי האנדותל (BMEC) שמהווה חלק בלתי נפרד של מחסום הדם-המוח-מחסום מאוד מיוחד (BBB). BMECs הם מחוברים על ידי חלבוני junctional המצורפים קרום במרתף. יחד עם pericytes, תאי שריר חלק, רגלי סוף astrocytic ותאי דם במחזור הם לבנות את היחידה שנקרא עצבים וכלי הדם (NVU) 1. נגד הרעיון הקודם של מחסום בלתי חדיר בין העצבים-המערכת-המרכזית (CNS) בדם ו, NVU הוא ממשק דינמי, מאוד ספציפי ופיקוח השולט על המעבר של נוזלים, מולקולות ותאים בין כלי דם במוח ומערכת העצבים המרכזיים 2 . תפקוד לקוי או חוסר ויסות של NVU עשוי ליזום ו / או לתרום למגוון רחב של עצבים וכלי דם, מחלות זיהומיות, דלקתיות או ניוונית של מערכת העצבים המרכזית, כגון שבץ איסכמי, HIV-אנצפלופתיה, טרשת נפוצה, מחלת פרקינסון 3-6 באלצהיימר או ב. _content &quot;&gt; monolayer BMEC הוא סגור היטב על ידי מורכב junctional היווה של הדוק (TJ) וadherens צמתים 7. ההתנגדות החשמלית הגבוהה וחדירות paracellular הנמוכה של BBB (AJ) מבוססים בעיקר על חלבוני TJ 8. TJS הם מתחמים שהוקמו על ידי החלבונים הטרנסממברני של משפחת claudin וoccludin, שהנם צמודים לשלד התא של תאי האנדותל על ידי מולקולות מתאם, כגון zonulaoccludens (ההסתדרות הציונית) חלבוני ZO1-3 4. צמתים Adherens בעיקר שנאספו על ידי חלבון הקרום נפרד -cadherin כלי דם האנדותל (VE), אשר קשור לשלד התא באמצעות catenins 8. האיטום ההדוק של BBB מונע מעבר חופשי של מצעים ותאים בין הדם לCSF. יוצאים מכלל זה הם מולקולות lipophilic, קטנות עם משקל מולקולרי &lt;400 Da, אשר מסוגל לחצות את BBB על ידי דיפוזיה בתיווך שומנים 9. המעבר של גדולים ו / אומולקולות הידרופילי, כגון גלוקוז, חומצות אמינו, פפטידים, חלבונים ותרופות רבות מוגבלת למערכות מבוקרות מאוד transcellular תחבורת 10, אשר יכול להיות מסווגת לחמש קטגוריות עיקריות: תחבורה בתיווך מוביל, הובלת יון, תחבורת זרימה פעילה, קולטן בתיווך תחבורה, ותיווך caveolae תחבורה 4. מערכות טרנספורטר אלה מסייעים לשמור על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית, אשר נדרש עבור דור אות מדויק, התמרה ואינטגרציה. יתר על כן, BMECs מסוגל לשלוט באופן פעיל את המעבר של מולקולות שונות על ידי הביטוי של מגוון רחב של ectoenzymes. אנזימים אלה הם נקודות על פני התא ולשנות מצעים במשק ומחוצים ספציפיים פוגעים או מאפשרים את המעבר של 11 BBB. ואילו מערכת העצבים המרכזית נחשבת כאיבר חיסוני הרשאות לזמן ארוך, ממצאים חדשים מורים על מערכת ולא דינמית וחזק מוסדרת של surv חיסוניeillance של מערכת העצבים המרכזית. BMECs מעורב באופן ביקורתי ברגולציה של גלגול תא חיסוני. על ידי הביטוי של selectins על הלימפוציטים משטחם באופן סלקטיבי מושרה לצרף לאנדותל באופן רופף. הפרשת כמוקינים שנתקלים עם קולטן ספציפי על כדוריות דם לבנות מובילה לביטוי או שינויי קונפורמציה של integrins ויקוציטים, כגון LFA-1 (פונקצית הלימפוציטים קשור אנטיגן-1) וVLA-4 (אנטיגן-4 מאוד מאוחר). Integrins לתווך הידבקות חברה באמצעות קשירת counterreceptors אנדותל, למשל VCAM-I (מולקולת הידבקות תא וכלי דם),-אני ICAM (מולקולת הידבקות אינטר) המאפשר הגלגול לתוך parenchyma המוח בין אם באמצעות BMECs של 12-14 BBB. אלה וממצאים אחרים מדגישים את התפקיד הפעיל של האנדותל עצמו בהסדרת נדידת תאים חיסונית. יתר על כן, BMECs כחלק מNVU מעורב בוויסות של זרימת דם המוחי linked לדרישות המטבוליות עצביות מקומיות. על גירוי astrocytic תאי האנדותל לייצר חומרי vasoactive כגון תחמוצת חנקן שמובילה להרפיה של תאי שריר חלק בכלי דם 15. אנגיוגנזה ונוירוגנזה בפיתוח, כמו גם בדפוסים מקבילים תכנית המוח הבוגרת ופיתוח ולשתף את נכסים רבים של רגולציה 1, 4. תאי האנדותל מעורבים באופן ביקורתי בתהליכים אלה 16, 17. לסיכום, BMECs מספק תכונות חיוניות כדי להצדיק פיתוח ותפקודה תקין של מערכת העצבים המרכזית. תפקוד לקוי של BBB קשור להפרעות רבות נוירולוגים חמורות. עם זאת, רק מעט מאוד מטרות זוהו בממשק המוח-כלי דם לטיפול ספציפי ויעיל 18. פשוט במודלים חוץ גופית היה בשימוש כדי להבין את המנגנונים מעורבים בתפקוד ורגולציה של מערכות פיזיולוגיות מורכבות עבור loזמן ng. הבידוד כפי שתואר על ידי כתב היד הזה והמחקר במבחנה של BMECs העכברי, בהתחשב במגוון הרחב של נוקאאוט-זני עכבר ספציפי, עשוי לספק הבנה נוספת של פונקצית BBB ורגולציה בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological פתיחת אפיקים טיפוליים חדשים.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basic fibroblast growth factor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>High relative level of protease activity</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenase from &lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt;, Dispase from &lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulant</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plasma-derived serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Warm to room temperature before use</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Should only be used in first 2 days of culture</td></tr></tbody></table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

מייד לאחר בידוד, BMECs העכברי ותאים לזהם ליצור קונגלומרטים צף במדיום תרבות תא (איור 1 א, יום 0). הטיפול בpyrumycin מוביל לבחירה של BMECs העכברי שכן הם מבטאים רמות גבוהות של מובילים בזרימת כגון P-גליקופרוטאין מוביל להתנגדות ביחס לרעלים. תאי זיהום הם הרבה יותר רגישים לpyrumycin cytotoxicity תיווך 19. במהלך התהליך של בחירת pyrumicin, תאים מזהמים להיכנס מוות של תאים אפופטוטיים או נימקי, ואילו MBMECs מתחיל לצרף לקולגן IV / צלחות פיברונקטין מצופה תרבית תאים (איור 1 א, 1 היום ויום 2). עד שהיום 5, MBMECs להתרבות לצפיפות של כ. 80-90%. הם מאופיינים במראה האופייני דמוי כישור. בנקודת מפגש, הם יוצרים monolayer של תאי קשר עכבות שאינן חופפים צפופים, מיושר אורכית ו( איור 1 א, יום 5). על ידיבחירת pyrumicin, טוהר גבוה של עד 99% MBMEC הוא הגיע, כפי שהודגם על ידי סמן אנדותל תאי CD31 (PECAM1; איור 1). MBMECs יוצר בחוזקה monolayers האטום מחובר על ידי חלבוני צומת הדוקים. אחרי 7 - 8 ימים של תרבות, שכבות תאי אנדותל לבנות את הערכים יציבים להתנגדות חשמלית (לכת ערכים טיפוסיים בין 20-30 Ω x 2 סנטימטר). והקיבול (איור 1 ג &#39;) בנקודת זמן זו מבחני תפקודיים כגון תאי ד&#39; ניסויי הגירה 3, 20,21 וחדירות בדיקות, למשל עם אוונס כחול או Dextran, יש לבצע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. מורפולוגיים ומאפיינים פונקציונליים של Murine BMECs. (א) במהלך BMECs התרבותי שנצפה על ידי מיקרו אור שידור בזמן הנציגscopy מעל 5 ימים. סרגל קנה מידה חל על כל התמונות. מכתים immunofluorescence (ב &#39;) לCD31 סמן תא אנדותל ביום 5. CD31 (ירוק) ו DAPI (כחול). תאים (ג) היו precultured במשך 5 ימים ולאחר מכן הועברו למערכת אוטומטית ל ניתוח של מאפייני biophysical (התנגדות וקיבוליות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.3K Views.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Video: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Developmental Biology

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Medicine

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Biology

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...