שימוש בפרוטוקול זה להסרת הווריאציה הבין-מדגמית יכול להציע תובנות לגבי הרגולציה ההדיפרנציאלית של מקרומולקולות המבוססות על פערים תוך-מדגמיים בין רמות mRNA וחלבון. שימוש באותה דגימה כדי לבודד דנ"א, רנ"א וחלבון הוא ניסיון להפחית את השונות, לשפר את הרבייה ולאפשר פרשנות. היתרונות כוללים זמן ומשאבים שמורים בזמן איסוף דגימות וניתוח חתך של דגימות יקרות ערך ומוגבלות.
כדי להתחיל, זרע 1, 000 ביצי תולעת בצלחת אחת 10 ס"מ עם תנאי צמיחה מתאימים. דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר של חיץ M9 ולהעביר 1,000 תולעים בוגרות לתוך צינור.
צנטריפוגה התולעים ב 1, 000 גרם לדקה אחת, להשליך את supernatant, ולהעביר את התולעים גלולה, עם מיליליטר אחד של חיץ M9, לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה שוב ב 845 גרם לדקה אחת ולהשליך את רוב supernatant. לאחסן את התולעים גלולה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך יותר מארבע שעות.
לאחר מכן, הסר כל על-טבעי מהכדור המופשר. מוסיפים מיליליטר אחד של סוג GTCP קר, מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה וממקמים את המדגם על הקרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של כלורופורם קר.
לנער את הצינור במרץ במשך 15 שניות ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 13, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. עם מיקרו-פיפטה, העבר את השכבה העליונה הברורה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ללא RNase באורך 1.5 מיליליטר.
מעבירים את שכבת האינטרפאז הלבנה המעוננת לצינור חדש המסויים B2 ומעבירים את השכבה הוורודה, מהכדור הנותר, לצינור חדש שכותרתו B ומ מניחים את שניהם על קרח. הפרדת שלוש השכבות עשויה להיות קשה. אני ממליץ להעביר את שכבת האינטרפאזה המעוננת לצינור שלה במקום לזרז את הדנ"א משכבה זו מהשכבה האורגנית, או הוורודה.
כדי לבודד את ה-RNA, הוסיפו תחילה 500 מיקרוליטרים של 100% isopropanol לצינור A כדי לזרז את ה-RNA. לאחר מכן, הדגירה את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינור ב 13, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של 75% אתנול לצינור A לשטוף את גלולה. צנטריפוגה הצינור ב 5, 300 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי ותנו לאוויר הכדור להתייבש למשך 5 עד 10 דקות.
מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase כדי להקים מחדש את גלולת ה-RNA ולהדרור את גלולה ב 55 עד 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להמיס אותו. לבסוף, השתמשו בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז ה-RNA המבודד ב-260 ננומטר ולזהות זיהומים ב-230 ו-280 ננומטר. כדי לבודד את הדנ"א, הוסיפו תחילה 300 מיקרוליטרים של 100% אתנול לשלב האורגני בצינור B ולשכבה הלבנה המעוננת בצינור B2 כדי לזרז את הדנ"א, לערבב לפי היפוך ולהשאיר את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד שלוש דקות.
לאחר מכן, צינורות צנטריפוגה B ו- B2 ב 376 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה DNA. ערבבו את העל-טבעי מצינורות B ו-B2 בצינור חדש של שני מיליליטר המסומן C ומשאירים אותו על הקרח לבידוד החלבון הבא. לאחר מכן, לשטוף את גלולת ה-DNA בצינור B2 עם מיליליטר אחד של 0.1 ציטראט נתרן טוחן ב 10%אתנול במשך 30 דקות.
צינור צנטריפוגה B2 ב 376 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. חזור על שלב הכביסה ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולה ב 1.5 מיליליטר של 75% אתנול ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, צינור צנטריפוגה B2 ב 376 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן להשליך את supernatant ולאפשר את גלולה להתייבש במשך חמש עד 10 דקות.
ממיסים את גלולה ב 150 microliters של שמונה מיליליטר נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 376 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לבסוף, עם מיקרופיגט, להעביר את supernatant המכיל את ה-DNA לצינור חדש.
השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז הדנ"א המבודד ב-260 ננומטר ולזהות זיהומים ב-230 ו-280 ננומטר. כדי לזרז את החלבון, תחילה להוסיף עד 1.5 מיליליטר של 100% isopropanol כדי עלנט ורוד בצינור C, לערבב על ידי היפוך מספר פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן, צינור צנטריפוגה C ב 13, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השליכו את העל-טבעי ושטפו את גלולת הכדור עם שני מיליליטר של 0.3 גואנידין הידרוכלוריד טוחן ב-95% אתנול למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה הצינור שוב ב 5, 300 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולחזור על צעד לשטוף כמו קודם. מעבירים את גלולת החלבון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המסומנים C2 ומוסיפים עד 1.5 מיליליטר של 95% אתנול, מערבולת, ותנו לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
צנטריפוגה הצינור ב 5, 300 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי ותנו לכדור להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, ממיסים את גלולה ב 300 microliters של 5% SDS ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
לבסוף, צנטריפוגה הצינור ב 13, 500 גרם ב 17 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ולהעביר את העל-טבעי המכיל את החלבון לצינור חדש. כדי לבצע PCR שעתוק הפוך כמותי.
ראשית, השתמש בננוגרם אחד של ה- RNA המבודד כדי להכין cDNA על ידי שעתוק הפוך. כדי להפוך צלחת מלאי של cDNA, להוסיף 100 microliters של אחד עד 100 דילול של כל מדגם cDNA ל בארות בודדות של צלחת 96 באר, כוללים פקדים מתאימים, כגון בארות מים בלבד דגימות מדוללות סדרתית, כדי ליצור יעילות פריימר עבור כל גן. כדי ליצור תערובת אב עבור כל קבוצה של פריימרים, להוסיף עד שבעה מיקרוליטרים של מים, צבע ציאניד בין DNA, וחמישה מיקרו-דיוחים כל אחד מראש קדימה ואחורי.
הוסף שבעה מיקרוליטרים של תערובת האב ל בארות המתאימות של צלחת RT-qPCR. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של cDNA מצלחת המניות ולהפעיל את הצלחת באמצעות פרוטוקול RT-qPCR מתאים פריימרים בשימוש. ניתוח RT-qPCR של mRNAs מבודדים מארבע דגימות עצמאיות של שלושה זנים תולעת נעשו כדי לאשר את המטרות שזוהו על ידי RNA seq בדיקה.
הגן F07C4.12 היה מוסדר בשתי המדגעים בתולעים eat-2, אבל upregulation שלה תולעים rsks-1 לא זוהה על ידי RT-qPCR מראי. כמו כן, RNA seq זיהה שינויי ביטוי של mrp-1 בתולעים eat-2 ו rsks-1 אושרו באמצעות RT-qPCR. Upregulation או למטה ויסות של גנים סמן organelle בתולעים מוטנטים זוהו גם על ידי ניתוח RT-qPCR.
השוואה בין GTCp לחלבון המופק מ-RIPA בתולעים המופרדות על ידי דף SDS ומוכתמות בכחול קומאסי הראתה איכות דומה עם רזולוציה טובה יותר של חלבונים גדולים יותר לחלבונים המופקים מ-GTCp. ניתוח כתם מערבי הראה רמות חלבון דומות ברוב המקרים;עם זאת, החלבונים הגדולים מ -75 קילודלטון הראו רמות נמוכות יותר בחלבון המופק RIPA. ההשוואה בין רמות mRNA וחלבון מארבע דגימות בודדות של שלושה זנים תולעת הראתה שונות נמוכה של רמות mRNA עם שונות רבה יותר ברמת החלבון.
בהקשר של בידוד DNA, התשואה תלויה מאוד במיומנות לשחזר את שכבת האינטרפאזה המעוננת מהשכבה האורגנית, או הוורודה. כדי לשפר את מסיסות של חלבונים מן גלולה להגדיל את נפח מאגר resolubilization או הוספת חומרי ניקוי אחרים מלבד SDS עשוי להיות נחוץ. שימוש בשיטה זו יכול לסייע בזיהוי נכון של מקרים שבהם תרגום של mRNA לחלבון אינו ליבלטיטיבי והוא יכול להוביל לחקירה מעמיקה יותר של מנגנוני רגולציה שלאחר שעתוק ופוסט-תרגום בתנאים שונים.
במעבדה שלנו, פרוטוקול זה שימש לשימור דגימות ליבת זמן יקרות ומוגבלות. יתר על כן, אני יכול לדמיין שזה יהיה פרוטוקול שימושי לאמץ בתחום השעון הביולוגי. הריג'נט GCTP וממסים המשמשים בבידוד RNA הם סכנות ויש להשתמש בהם בזהירות.
