תאי מונונוקלאר שקדים רלוונטיים ומורכבים יותר מתאי דם, ובידודם מאפשר לחקור את תגובת תאי החיסון בפתולוגיות הכוללות חסינות ריר. הטכניקה שהקמנו מאפשרת התאוששות של מספר רב של תאים חיסוניים מרקמה ריר תוך שמירה על שלמותם למחקרי אקס ויוו. השיטה היא פשוטה למדי, אבל השקדים צריכים להיות מטופלים במהירות ובזהירות על מנת למקסם את התשואה.
להעביר את רקמת השקדים האנושית למעבדה כמתואר בטקסט כתב היד. לאחר מכן, מניחים את מסננת התא על צלחת תרבות 150 על 25 מילימטר. מניחים את כל כלי הניתוח בצלחת אחרת כדי לשמור אותם סטריליים.
כל הדגימות העיקריות שלך צריך להיות מטופל בזהירות כפי שהם לא היו מוסמכים בעבר עשוי להכיל סוכנים זיהומיות. ואז לשפוך את PBS מן הבקבוקון לתוך מסננת, כי זה יכיל כמה תאים כי יש יציאה השקדים. באמצעות מטלאים סטריליים, להעביר את השקדים מן הבקבוקון לתוך צלחת התרבות באמצעות מטלאים סטריליים.
במידת הצורך, הוסף PBS נוסף כדי לטבול את הרשת. הניתוח ייקח בערך 45 דקות לכל שקדים. זה חיוני כי במהלך תקופה זו השקדים שקועים כדי להבטיח כדאיות טובה ותפוקת התא.
הסר רקמה מדממת שרירן צרוב באמצעות ממטרות ואזמל. בעזרת האזמל והפינצטה המעוקלת, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בקוטר של פחות מחצי סנטימטר. חותכים את כל הרקמה, כך חתיכות קטנות ניתן לטבול בכל עת.
מניחים כמה חתיכות של רקמה מסננת התא. מגרדים אותם לרשת עם עלה זכוכית עד שנותרה רק שכבה דקה מאוד של סטרומה לבנה. הסר ומחק את הסטרומה כדי למנוע סתימת הרשת.
לאחר מכן השתמש פיפסה 10 מיליליטר כדי להעביר את ההשעיה התא לרשת ולגרד אותו בפעם האחרונה. לאחר מכן, השתמש פיגט 10 מיליליטר כדי להעביר את ההשעיה התא לתוך בקבוקון סטרילי. לשטוף את הרשת ואת מסננת התא עם PBS פעם אחת, ולהעביר את PBS לבקבוקון גם.
לפני שתמשיך לתת את ההשעיה התא לנוח על הספסל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים מסמר 70 מיקרומטר סטרילי על גבי בקבוקון חדש של 50 מיליליטר. מעבירים בעדינות את ההשעיה של התא אל המסמר עם פיפסה של 10 מיליליטר.
אם המנזר סתום, השתמש בחלק האחורי של קצה פיפיאט סטרילי של מיליליטר כדי לגרד את התאים דרך המנזר. שנה את המסנב לעתים קרובות ככל הנדרש. צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה, השלך את העל-טבעי. להשעות מחדש את גלולה על ידי הקשה בעדינות על הבקבוקון, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 35 מיליליטר של PBS. כדי להשלים את השלב הראשון של בידוד התאים, מניחים מסמרון חדש של 70 מיקרומטר על גבי בקבוקון חדש ומעבירים אליו את מתלי התא עם פיפיאט של 10 מיליליטר.
כדי להשיג פתרון תא ברור יותר, התחל בהוספת 15 מיליליטר של מדיום הדרגתי בצפיפות לבקבוקון חדש של 50 מיליליטר. יוצקים את פתרון TMC על גבי המדיום הדרגתי צפיפות, נזהר למזער את הערבוב. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 1000 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה ובלם כבוי.
לאחר הסרת הבקבוקון מהצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להסיר ולהשליך את השכבה העליונה. אל תפריע לממשק בין ה- TMCs לבין מדיום מעבר הצבע של הצפיפות. לאחר מכן הסר את TMCs עם קצה פיפטה סטרילי אחד מיליליטר ולהעביר אותם לבקבוקון חדש 50 מיליליטר.
כדי לשטוף את התאים, תחילה להוסיף 50 מיליליטר של PBS המכיל 2%סרום בקר עוברי ו 2 מילימולרי EDTA. ואז צנטריפוגה הצינור ב 250 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שוב, אבל הפעם צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הכן את מדיום תרבות R10 על ידי השלמת RPMI 1640 עם FBS מושבת בחום של 10%, 2 מילימולרים L-גלוטמין, ואת הפתרון האנטיביוטי. להשעות מחדש את TMCs ב 10 מיליליטר של R10. אז תספור את התאים.
ניתן להשתמש בתאים באופן מיידי או להקפיא אותם לשימוש עתידי כמתואר בכתב היד. TMCs היו מוכתמים, דגירה עם נוגדנים, מאופיין באמצעות ציטומטריה זרימה. TMCs הכילו את כל סוגי תאי החיסון העיקריים הקיימים בתאים חד-גרעיניים היקפיים מדם, PMBC מקוצר.
עם זאת, התדרים של כל סוגי התאים, למעט תאי B, היו נמוכים יותר ב- TMCs מאשר במחשבים אישיים. כדי לחקור את הפעלת התא בייצור ציטוקינים, TMCs היו מגורה בן לילה עם R848 resiquimod. TMCs, התווה בכחול, הפיק את כל הציטוקינים שנבדקו למעט IFN Lambda 2/3 ו IL-8, אם כי הייצור היה נמוך יותר מאשר PBMCs, התווה בירוק.
עליות קיפול השוואת גירוי R848 ללא גירוי נרשמות באדום. גושי רקמה מטוהרים ומבודדים, כחולים ושקדים, כתומים, היו מגורים במשך 24 שעות עם שפעת A וירוס, IAV. ייצור IFN זוהה ב- TMCs אך לא ב- supernatant של גושי הרקמות המציין כי מתפוצצי רקמות אינם המודל הטוב ביותר לחקר הפרשת ציטוקינים והפעלת תאים.
לאחר הדגירה מראש עם התרופה הרעילה C1 וגירוי עם R848, TMCs ו- PBMCs הומתו על הכדאיות. TMCs היו רגישים יותר ל- C1. זה מרמז כי תרופות חדשות בטיפולים עתידיים צריך להיבדק בתאים מרקמות, לא רק על קווי תאים, PBMCs, או מתפוצץ רקמות. הליך זה מאפשר לנו להשתמש TMCs כמו PBMCs מדם שלם ולבצע את אותם ניסויים הסלולר כגון טיהור של סוג תא מסוים, תרבות התא, ציטומטריה זרימה או הקפאה.
בידודים של TMCs מאפשר לאפיין טוב יותר, במודל רלוונטי, את התגובה החיסונית באיברים לימפואידיים משניים בפתולוגיות הכוללות חסינות ריר.
