פרוטוקול זה נועד לחקור שיחה צולבת של תאי אפיתל ותאי חיסון מולדים מהשורה הראשונה, במיוחד תאי T מולדים, וזה העניין שלנו. תאים ראשוניים ממקורות אנושיים משמשים בטכניקה זו, המאפשרת חקירה פרטנית של הצלב הפיזיולוגי הרלוונטי למה שקורה בבני אדם. תאי T מולדים היו מעורבים בשיפור ההישרדות של חולים נגועים בשפעת.
לדעת איך הם מקבלים מופעלים יכול לעזור בפיתוח אנטי שפעת וטיפול אנטי ויראלי. שיטה זו נועדה לזהות גורמים שיכולים להפעיל את תאי ה- T המולדים, אשר עשויים לסייע בפיתוח אמצעי מניעה נגד הידבקות בנגיף בדרכי הנשימה. ביום אפס, להדביק תאי אפיתל האף האנושי, או HNECs.
ראשית, לספור תאים על ידי הוספת 150 microliters של 1x טריפסין EDTA לתא apical של תוספת הממברנה ו 350 מיקרוליטרים של 1x טריפסין EDTA לחדר הבסיס של הבאר הייצוגית. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או עד התאים להתנתק מן הממברנה. לשטוף את התאים על הממברנה על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאסוף את ההשעיה בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
הוסף 200 מיקרוליטרים של DMEM כדי להרוות את פעילות הטריפסין. לאחר מכן, לספור תאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. חשב את הריבוי הנדרש של זיהום, או MOI, של הנגיף בהתבסס על ספירת התאים לבאר.
לדלל את מלאי הווירוס בהתאם עם RPMI מלא על קרח. עבור הבארות הנותרות לניסוי הזיהום, להוסיף אחד 1x DPBS לתוך החדרים האפיים של מוסיף הממברנה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהסיר את 1x DPBS.
שנה את המדיום הבסיסי בממברנה מוסיף כדי להשלים מדיום RPMI על ידי העברת התוספות לצלחת חדשה עם RPMI מלא הוסיף הבארות. הוסף את inoculum וירוס מוכן לתוך התא האפוי של תוספת הממברנה. יש לדגור ב-35 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת ולהסיר את האינוקלום הנגיפי מתא האפי.
שנה את המדיום הבסיסי של תוספת הממברנה למדיום RPMI טרי ודגר ב 35 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% פחמן דו חמצני במשך 24 עד 72 שעות. זרע את המספר הנדרש של תאים חד גרעיניים בדם היקפי, או PBMCs, במדיום RPMI מלא על ידי הוספה ישירה של השעיית PBMC לתא הבסיס של כל באר של HNECs נגועים מיום אפס. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות.
כדי לאסוף את supernatant apical, להוסיף 1x DBPS לכל תא apical ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לאסוף את DPBS בצינורות 1.5 מיליליטר. Aliquot supernatant עבור בדיקת פלאק בצינור חדש 1.5 מיליליטר ומיד להקפיא הן את המניה ואת aliquots במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי לאסוף HNECs בצורת RNA, להעביר את תוספת הממברנה לבאר נקייה. מוסיפים את מאגר תמוגת הרנ"א לתא האפוי ודגורים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מיצוי RNA לניתוח מולקולרי.
לבסוף, לקצור PBMCs על ידי גירוד בעדינות את פני השטח של הבאר עם הבסיס הרחב של קצה פיפטה סטרילי כדי לחלץ את המחשבים PBMCs מופעלים שעשויים להיות דבקים על פני השטח של הבאר. לאסוף את המדיום הבסיסי המכיל PBMCs בצינור צנטריפוגה שני מיליליטר. לשטוף את הבארות פעמיים עם 300 microliters של 1x DPBS ולאסוף את הכביסה באותו צינור שני מיליליטר.
צנטריפוגה צינור שני מיליליטר ולאסוף את supernatant בצינור שני מילימטר טרי מבלי להפריע גלולה התא. אחסן את הסופר-נרטיב השאפתן במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח ציטוקינים וכימוקין. Resuspend גלולה התא הנותרת ב 200 microliters של 1x DPBS.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד תאי T מולדים בעקבות זיהום שפעת ללא צורך בתאי אפיתל ומערכת החיסון מאותו תורם. מדגם של ההתקדמות הצפויה של HNESPCs כפי שהם גדלים על שכבת מזין 3T3 מוצג כאן. אלה שימשו לבידול בתרבית ממשק האוויר/נוזל כדי להשיג HNECs רב שכבתיים עם תאים פונקציונליים, ciliated, וגביע.
באמצעות HNECs, הפעלת תאי T מולדת ניתן לחקור באמצעות cytometry זרימה. תוצאות אלה מראות את הזיהוי של תאי T invariant הקשורים לרית, או תאי MAIT, דלתא V אחד, תאי דלתא גמא T, ואת הרוצח הטבעי T, או תאי NKT. תאים אלה גדלו באופן משמעותי בתרבות משותפת מעורבים HNECs נגועים בנגיף שפעת.
התקנה זו יכולה להיות מיושמת לאחר מכן על זני וירוס שפעת אחרים, או אוכלוסיות תאי מערכת החיסון המולדת כדי לבחון את ההפעלה שלהם בהתאמה בתנאי תרבות משותפת עם תאי אפיתל נגועים. חישוב מדויק של מספר תאי האפיתל של האף האנושי כדי להבטיח כי ריבוי נכון של זיהום משמש חשוב עבור רמות אופטימליות ותזמון של הפעלה. שיחה צולבת בין תאי אפיתל לתאי מערכת החיסון המולדים צוברים יותר ויותר תשומת לב, וזה יכול להיות מיושם עוד יותר על כל שיטות אחרות המערבות אימונולוגיה נשימתית חריפה או כרונית.
