פרוטוקול זה מספק שיטה לבודד קרדיומיוציטים בצורת מוט מכל רקמת לב, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי למדוד תכסיסים וגרעין מצב של cardiomyocytes אלה ללא ניתוח ידני. בהשוואה לטכניקות אחרות, הפרוטוקול שלנו מספק תפוקות תאים ומורפולוגיה של תאים עקביים יותר, ונגד ציטומטריית זרימה, אנו מסוגלים לאמת חזותית את מצב הגרעין והתכסיסים של קרדיומיוציטים. ההדגמה החזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שקל יותר להעריך את חלוקת רקמת הלב וההתאגדות.
התחל על ידי הצבת העכבר המתת חום עלות, והדבקת הגפיים המורחבות. השתמש במספריים קהים כדי לחתוך דרך החזה כדי לחשוף את הלב. ואז לחתוך את בית ההיתוך יורד ו vena קאווה נחות.
השתמש במשאבה פריסטולית המחוברת ערכת עירוי עם מחט פרפר 23 מד כדי לבלבל את הלב על ידי הזרקת שלושה מיליליטר של אשלגן כלורי PBS פתרון דרך החדר השמאלי. הקפד לא לנקב דרך מחיצה. ואז להזריק 10 מיליליטר של 4% פתרון PFA במשך 10 דקות בקצב של מיליליטר אחד לדקה.
השתמש במספריים כדי להסיר את כל הלב. ואם תרצה, לבודד אזור מסוים. מניחים את הרקמה בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 4%PFA פתרון.
דגירה זה על נדנדה במשך שעה אחת. מניחים את הלב בצלחת פטרי עם פתרון PBS. לסחוט אותו כדי להיפטר כל PFA שנותר בחדרים ולשטוף אותו PBS.
שים את הלב הקבוע לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר המכיל פתרון קולגן. ואז להדרגר את הלב על נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשים את הלב בצלחת פטרי 35 מילימטר המכיל תווי קולגן, ולנתק אותו לחתיכות מילימטר אחד עם מטח או מספריים.
לאחר מכן השתמש פיפטה העברה כדי עוד יותר triturate הרקמה ניתוק במשך שתי דקות. אם חלקיקי רקמה עדיין נשארים, השתמש פיפטה עם קצה צר יותר ולהמשיך trituration עד שרוב הרקמה מתפרקת. מניחים רשת ניילון 200 עד 600 מיקרומטר מעל צינור צנטריפוגה 15 מילימטר.
הוסף חמישה מיליליטר של PBS לתאים המנותקים וסנן אותם דרך רשת הניילון. לשטוף את רשת ניילון על ידי העברת ארבעה מיליליטר נוספים של PBS. ואז צנטריפוגה הפתרון מסונן ב 10 עד 100 פעמים G לדקה אחת.
להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של PBS לפני הכתמים. לאחר הורדת הפצת פיג'י של תמונה J, פתח את פיג'י ולחץ על עזרה, עדכון וניהול אתרי עדכון. בדוק את הקבוצה ביומד ותוספי IFPB.
כדי להוריד את התוספים יחסי תלות, אליפסה לפצל מורפו ליב J.Then לחץ על סגור ולהחיל שינויים. לאחר מכן, להוריד RStudio ולפתוח אותו. העתק את הקוד מתוך כתב היד של הטקסט לתוך שורת הפקודה של RConsole והקש enter.
לאחר מכן הקלד Y בתגובה לכל ההנחיות להתקין את כל יחסי התלות שלנו. כדי לבצע כימות תמונה, פתח את פיג'י וגרור ניתוח. py לתוך שורת המצב.
כאשר חלון עריכת ה- Script נפתח, לחץ על הפעל בפינה הימנית התחתונה. תצוץ תיבת דו-שיח המבקשת את המיקום של ספריית נתוני הפלט. בחר את התיקיה שבה יאוחסנו כל נתוני הניתוח, הנתונים ונתונים אחרים המשמשים את התוכנה.
בפרמטרי הניתוח, בחר את מיקום התמונות שיש לנתח והזן את תבנית שם קובץ התמונה באמצעות ביטויים רגילים. לאחר בחירת ההגדרות הרצויות, לחצו על הלחצן 'אשר'. כאשר תמונות מהשלבים השונים של צינור הניתוח מופיעות על המסך, בדוק אותן כדי לוודא שהסף והפילוח מתרחשים כראוי. פתח שרת ניתוח.
r ברסטודיו. לאחר מכן, לשם התיקיה בעל שם המשתנה, הקלד את נתיב הקובץ לתיקיית נתוני הפלט שנבחרה בשלב האחרון ללא קו הנטוי הסופי. לחץ על הפעל אפליקציה בפינה הימנית העליונה של חלון עריכת קובץ ה- Script.
השתמשו במ המחוונים כדי לקבוע סף לסף העוצמה המינימלי החוקי של הממוצע הגרעיני, לסף השטח הגרעיני החוקי המינימלי ולקוטר החמוסים המינימלי החוקי המרבי לקרדיומיוציטים. גלול מטה ולחץ על החל סף נבחר ולאחר מכן לחץ על התפלגות עוצמת התוויה, שתהפוך חלקה מהתפלגות עוצמת הגרעין של המדגם כולו וכן תת-פלוט נפרד עבור כל משתנה קיבוץ. כדי להסביר וריאציה תוך-סומסמית, גלול מטה ובדוק נורמליזציה בנפרד לפי קבוצה ולאחר מכן לחץ על חשב תכסיס והתוויה של התפלגות תכסיסים משוערת.
לאחר שגרף הדגימה כולו מנורמל מופיע, שתי תבניות השיא צריכות להיות גלויות. השתמש במחוונים ובחר סף כדי לבודד את פסגות diploid ו tetraploid אחד מהשני חריגים. לאחר מכן גלול מטה ולחץ על חשב תכסיס וגרעין.
לבסוף, לחץ על התוויית הלחצן ושמור בתיקיה תוצאות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד cardiomyocytes ייחודי באופן אחיד כי הם טהורים יחסית ללא תאים מזהמים. זה קל ליישם ומספק תשואות cardiomyocyte עקבי ואיכות מבידודים שונים.
קרדיומיוציטים מבודדים עם פרוטוקול זה יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים ו azides פלואורוכרום נדוש. כדי להראות את תבנית הכתמת קו Z האופיינית של סרקומרים, התאים היו מוכתמים בנוגדנים המכירים באלפא אקטין. בניסוי נפרד, EdU ניתנה לעכברים לפני בידוד קרדיומיוציטים קבועים.
לאחר הבידוד, זוהו הקרדיומיוציטים המונו-מונוקלציה, הנוקלציה והטרינוקלציה שעברו שלב S. כדי לזהות גרעינים בודדים, התמונה המוכתמת בדנ"א המקורית הייתה סף על סמך עוצמה. אליפסות היו מתאימות למסכות הגרעיניות, פילוח גרעינים בודדים.
לאחר מכן, הפיקסלים של התמונה מחולקים לשטחים המבוססים על האליפסה שאליה הם קרובים ביותר, וגבולות שטחים אלה שימשו לציור קווים באמצעות אשכולות גרעיניים. תהליך פילוח דומה שימש לגילוי קרדיומיוציטים. אסטרטגיית פילוח זו הראתה כי רוב הקרדיומיוציטים מעכברים שזה עתה נולדו הם מונונוקלציה.
התדירות של קרדיומיוציטים מונונוקלציה נמוכה בהרבה בעכברים בני שבועיים, שם הם חלקם כ -25% מכלל אוכלוסיית הקרדיומיוציטים. כאשר נמדד מצב התכסיסים של גרעינים בודדים בתוך קרדיומיוציטים, זוהתה תדירות גבוהה יותר של גרעיני טטרפלואידים בעכברים צעירים. בעת בידוד קרדיומיוציטים, חשוב לוודא שכל גושי התאים התפרקו מהטריטורציה שלהם.
