Этот протокол обеспечивает метод для изоляции стержня формы кардиомиоцитов из любой сердечной ткани, которые затем могут быть использованы для измерения плоидии и нуклеации статус этих кардиомиоцитов без ручного анализа. По сравнению с другими методами, наш протокол обеспечивает более последовательную урожайность клеток и морфологию клеток, и в отличие от цитометрии потока, мы можем визуально проверить нуклеацию и плоиди статус кардиомиоцитов. Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение, потому что разделение и ассоциация сердечной ткани легче оценить.
Начните с размещения усыпленной мыши в положении на спине, и лентой вниз расширенные конечности. Используйте тупые ножницы, чтобы прорезать грудь, чтобы разоблачить сердце. Затем вырежьте нисходящую аорту и адскую каву вены.
Используйте перистальтический насос, прикрепленный к набору инфузии с иглой бабочки 23 калибра, чтобы окутать сердце путем введения трех миллилитров раствора хлорида калия PBS через левый желудочек. Убедитесь в том, чтобы не пробить перегородку. Затем ввимим 10 миллилитров раствора 4%PFA в течение 10 минут со скоростью одного миллилитра в минуту.
Используйте ножницы, чтобы удалить все сердце. И при желании изолировать конкретный регион. Поместите ткань в 1,5 миллилитровую центрифугу, содержащую один миллилитр раствора 4%PFA.
Инкубировать его на рокер в течение одного часа. Поместите сердце в чашку Петри с раствором PBS. Сожмите его, чтобы избавиться от любых PFA оставшихся в желудочках и мыть его в PBS.
Поместите фиксированное сердце в новую 1,5 миллилитровую трубку, содержащую коллагенатный раствор. Затем инкубировать сердце на рокер при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день положите сердце в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую коллагеновый раствор, и развяжте ее на одну миллиметровую кусочки с помощью типсов или ножниц.
Затем используйте перенесите пипетку для дальнейшего тритурата диссоциированной ткани в течение двух минут. Если частицы ткани все еще остаются, используйте пипетку с более узким кончиком и продолжайте тритурацию до тех пор, пока большая часть ткани не будет разбита. Поместите нейлоновую сетку диаметром от 200 до 600 микрометров над 15-миллиметровой центрифугой.
Добавьте пять миллилитров PBS в диссоциированные клетки и отфильтруйте их через нейлоновую сетку. Вымойте нейлоновую сетку, пройдя дополнительные четыре миллилитров PBS. Затем центрифуга фильтруется раствор на 10 до 100 раз G в течение одной минуты.
Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 10 миллилитров PBS до окрашивания. После загрузки Фиджи распределения изображения J, открыть Фиджи и нажмите на помощь, обновление и управление обновления сайтов. Проверьте биомедицинскую группу и плагины IFPB.
Чтобы загрузить плагины зависимостей, эллипс разделить и морфо lib J.Then нажмите близко и применить изменения. Далее, скачать RStudio и открыть его. Скопировать код из текстовой рукописи в командную строку RConsole и нажмите введите.
затем введи Y в ответ на все подсказки для установки всех наших зависимостей. Для выполнения количественной оценки изображений откройте Фиджи и перетащите анализ. py в статус-бар.
Когда откроется окно редактирования скриптов, нажмите кнопку «Бег в левом нижнем углу». Всплывает диалоговое окно с запросом местоположения каталога выходных данных. Выберите папку, в которой будут храниться все данные анализа, цифры и другие данные, используемые программным обеспечением.
В параметрах анализа выберите местоположение изображений, которые будут проанализированы, и введите формат имени файла изображения с помощью обычных выражений. После выбора нужных настроек нажмите OK. По мере того, как изображения с различных этапов конвейера анализа отображаются на экране, проверяйте их, чтобы убедиться, что пороговые значения и сегментация происходят должным образом. Открытый анализмультинуцированный серватор.
г в Rstudio. Далее, к имени папки с переменным именем, ввемите путь файла к папке выходных данных, выбранной на последнем этапе без окончательного слэша. Нажмите запустить приложение в левом верхнем углу окна редактирования скрипта.
Используйте ползунки, чтобы установить пороговые значения для минимального допустимого порога ядерной среднего интенсивности, минимального допустимого порога ядерной зоны и максимально допустимого минимального диаметра хорьков для кардиомиоцитов. Прокрутите вниз и нажмите применить выбранные пороги затем нажмите распределение интенсивности участка, который будет оказывать участок распределения интенсивности ядра всего образца, а также отдельные подсюжеты для каждой переменной группировки. Для учета внутрисемейных вариаций прокрутите вниз и проверьте нормализацию отдельно по группе, затем нажмите вычислить ploidy и график предполагаемого распределения ploidy.
Как только нормализованный график всего образца появляется, два пиковых шаблона должны быть видны. Используйте ползунки и выберите пороги, чтобы изолировать диплоидные и тетраплоидные пики друг от друга и выбросы. Затем прокрутите вниз и нажмите вычислить ploidy и нуклеации.
Наконец, нажмите на кнопку участка и сохранить в папку результатов. Этот метод может быть использован для изоляции равномерно сингулярных кардиомиоцитов, которые являются относительно чистыми без загрязнения клеток. Это легко реализовать и обеспечивает последовательные выходы кардиомиоцитов и качество от различных изоляций.
Кардиомиоциты, изолированные с помощью этого протокола, могут быть окрашены с помощью антител и конъюгированных флюорохромных азидов. Чтобы показать характерный рисунок окрашивания линии сармеров, клетки были окрашены антителами, распознавающих альфа-актинин. В отдельном эксперименте, ЭдУ вводили мышам, прежде чем изолировать фиксированные кардиомиоциты.
После изоляции были обнаружены мононуклеированные, бинуклеированные и тринуклеированные кардиомиоциты, прошедшие S-фазу. Для идентификации отдельных ядер исходное изображение, окрашенное ДНК, было пороговым в зависимости от интенсивности. Эллипсы были пригодны для ядерных масок, сегментации отдельных ядер.
Далее пиксели изображения были разделены на территории, основанные на эллипсе, к которому они наиболее проксимальна, и границы этих территорий использовались для прорисовки линий через ядерные кластеры. Аналогичный процесс сегментации был использован для обнаружения кардиомиоцитов. Эта стратегия сегментации показала, что большинство кардиомиоцитов у новорожденных мышей мононуклеированы.
Частота мононуклеированных кардиомиоцитов значительно ниже у двухнедельных мышей, где они составляют около 25% от общей популяции кардиомиоцитов. При измерении плоидного статуса отдельных ядер в кардиомиоцитах у несовершеннолетних мышей была обнаружена более высокая частота тетраплоидных ядер. При изоляции кардиомиоцитов, важно проверить все клеточные сгустки распались от их тритурации.
