Questo protocollo fornisce un metodo per isolare i cardiomiociti a forma di asta da qualsiasi tessuto cardiaco, che può quindi essere utilizzato per misurare lo stato di ploidia e nucleazione di questi cardiomiociti senza analisi manuale. Rispetto ad altre tecniche, il nostro protocollo fornisce rese cellulari e morfologia cellulare più coerenti e, a differenza della citometria del flusso, siamo in grado di verificare visivamente la nucleazione e lo stato di ploidia dei cardiomiociti. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché la divisione e l'associazione dei tessuti cardiaci è più facile da apprezzare.
Inizia posizionando il topo eutanasiato in posizione supina e assottigliando gli arti estesi. Usa forbici dalla testa smussata per tagliare il petto per esporre il cuore. Quindi tagliare l'aorta discendente e la vena cava inferiale.
Utilizzare una pompa peristaltica attaccata a un set di infusioni con un ago a farfalla calibro 23 per perfondere il cuore iniettando tre millilitri di soluzione PBS di cloruro di potassio attraverso il ventricolo sinistro. Assicurarsi di non perforare il setto. Quindi iniettare 10 millilitri di soluzione 4%PFA per 10 minuti alla velocità di un millilitro al minuto.
Usa le forbici per rimuovere tutto il cuore. E se lo si desidera, isolare una regione specifica. Posizionare il tessuto in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di soluzione di PFA al 4%.
Incubalo su un rocker per un'ora. Mettere il cuore in una piastra di Petri con soluzione PBS. Spremere per sbarazzarsi di qualsiasi PFA rimanente nei ventricoli e lavarlo in PBS.
Mettere il cuore fisso in un nuovo tubo da 1,5 millilitri contenente soluzione di collagenato. Quindi incubare il cuore su un rocker a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, metti il cuore in una piastra di Petri di 35 millimetri contenente soluzione di collagenato e dissocialo in pezzi di un millimetro con forcette o forbici.
Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per triturare ulteriormente il tessuto dissociato per due minuti. Se le particelle di tessuto rimangono ancora, utilizzare una pipetta con una punta più stretta e continuare la triturazione fino a quando la maggior parte del tessuto non viene scomposta. Posizionare una rete di nylon da 200 a 600 micrometri su un tubo di centrifuga da 15 millimetri.
Aggiungere cinque millilitri di PBS alle celle dissociate e filtrarli attraverso la rete di nylon. Lavare la rete di nylon passando altri quattro millilitri di PBS. Quindi centrifugare la soluzione filtrata a 10-100 volte G per un minuto.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di PBS prima della colorazione. Dopo aver scaricato la distribuzione fiji dell'immagine J, aprire Fiji e fare clic su Aiuto, aggiornamento e gestione dei siti di aggiornamento. Controlla il gruppo biomed e i plugin IFPB.
Per scaricare i plug-in delle dipendenze, ellipse split e morpho lib J.Quindi fare clic su Chiudi e applica modifiche. Quindi, scarica RStudio e aprilo. Copiare il codice dal manoscritto di testo nella riga di comando di RConsole e premere INVIO.
quindi digitare Y in risposta a tutte le richieste di installare tutte le nostre dipendenze. Per eseguire la quantificazione dell'immagine, aprire Fiji e trascinare l'analisi. py nella barra di stato.
All'apertura della finestra di modifica degli script, fare clic su Esegui nell'angolo in basso a sinistra. Verrà visualizzata una finestra di dialogo che richiede il percorso della directory dei dati di output. Selezionare la cartella in cui verranno archiviati tutti i dati di analisi, le cifre e gli altri dati utilizzati dal software.
Nei parametri di analisi, selezionare la posizione delle immagini da analizzare e immettere il formato del nome del file di immagine utilizzando espressioni regolari. Dopo aver selezionato le impostazioni desiderate, fare clic su OK. Quando sullo schermo vengono visualizzate immagini provenienti da diverse fasi della pipeline di analisi, ispezionarle per assicurarsi che la soglia e la segmentazione si verifichino correttamente. Aprire analyzemultinucleatedserver.
r in Rstudio. Quindi, per il nome della cartella denominata variabile, digitare il percorso del file nella cartella dei dati di output selezionata nell'ultimo passaggio senza la barra finale. Fare clic su Esegui app nell'angolo superiore sinistro della finestra di modifica degli script.
Utilizzare i dispositivi di scorrimento per impostare soglie per la soglia minima di intensità media nucleare valida, la soglia minima valida dell'area nucleare valida e il diametro massimo valido dei furetti per i cardiomiociti. Scorrere verso il basso e fare clic su applica soglie selezionate, quindi fare clic sulla distribuzione dell'intensità del tracciato, che eseguirà il rendering di un grafico della distribuzione dell'intensità del nucleo dell'intero campione e di sottotrame separate per ogni variabile di raggruppamento. Per tenere conto della variazione intracampione, scorrere verso il basso e verificare la normalità separatamente per gruppo, quindi fare clic su Calcola distribuzione ploidia e traccia stimata ploidia.
Una volta visualizzato l'intero grafico del campione normalizzato, i due modelli di picco dovrebbero essere visibili. Usa i dispositivi di scorrimento e seleziona le soglie per isolare i picchi diploidi e tetraploidi l'uno dall'altro e gli outlier. Quindi scorrere verso il basso e fare clic su calcola ploidia e nucleazione.
Infine, fare clic sul plottaggio dei pulsanti e salvare nella cartella dei risultati. Questo metodo può essere utilizzato per isolare cardiomiociti singolarizzati uniformemente che sono relativamente puri senza contaminare le cellule. È facile da implementare e fornisce rese cardiomiociti coerenti e qualità da diversi isolamenti.
I cardiomiociti isolati con questo protocollo possono essere macchiati usando anticorpi e azidi coniugati fluorocromi. Per mostrare il caratteristico modello di colorazione della linea Z dei sarcomeri, le cellule erano macchiate di anticorpi che riconoscevano l'actina alfa. In un esperimento separato, l'EdU è stato somministrato ai topi prima di isolare i cardiomiociti fissi.
Dopo l'isolamento, sono stati rilevati i cardiomiociti mononucleati, binucleati e trinucleati che avevano subito la fase S. Per identificare i singoli nuclei, l'immagine originale macchiata di DNA è stata soglia in base all'intensità. Le ellissi erano adatte alle maschere nucleari, segmentando i singoli nuclei.
Successivamente, i pixel dell'immagine furono partizionati in territori basati sull'ellisse a cui sono più prossimali, e i confini di questi territori furono usati per disegnare linee attraverso ammassi nucleari. Un processo di segmentazione simile è stato utilizzato per rilevare i cardiomiociti. Questa strategia di segmentazione ha mostrato che la maggior parte dei cardiomiociti dei topi appena nati sono mononucleati.
La frequenza dei cardiomiociti mononucleati è molto più bassa nei topi di due settimane, dove covano circa il 25% della popolazione totale di cardiomiociti. Quando è stato misurato lo stato di ploidia dei singoli nuclei all'interno dei cardiomiociti, è stata rilevata una maggiore frequenza di nuclei tetraploidi nei topi giovani. Quando si isolano i cardiomiociti, è importante verificare che tutti i grumi cellulari abbiano rotto la loro triturazione.
