このプロトコルを使用すると、405ナノメートルレーザーを搭載した標準的な共焦点顕微鏡を備えたラボは、ヘアセル前駆細胞レーザーアブレーションを実行し、その再生を監視することができます。エレクトロアブレーションとは異なり、この技術は、周囲の細胞の損傷を制限し、強力なパルスUVレーザーセットアップよりもアクセスしやすいです。共焦点イメージングは、アブレーションの直前と直後に行うこともできます。
この技術は、人間の難聴の治療法の開発に役立つかもしれない感覚前駆物質の再生行動をよりよく理解することを可能にする。取り付けのために、最初のピペット3〜4ピペットは、14ミリメートル番号1.5カバースリップボトムで、35ミリメートル皿の中央にE3トリケーヌ溶液の小さな液滴に幼虫を麻酔します。余分な溶液を取り除き、幼虫がそれらを含むのに十分な大きさの小さな液滴に残るようにします。
そして、双眼鏡ステレオ顕微鏡のステージに皿を置きます。すべての幼虫が視野に入るようにズームとフォーカスを操作し、トランスファーピペットを使用してカバースリップにアグロ溶液の薄い層を追加します。余分なアグロスを取り除き、液体が皿の底の井戸を満たすまで、幼虫を吸引しないように注意してください。
そして、ヘアナイフを使用して、左向きのロストラル側でアグロ溶液中の幼虫を素早く向けます。幼虫をガラスに押し付け、右側を下に向けてプロファイルに幼虫が置きます。約60秒後、アグロは固まり始め、幼虫の向きを変えることができない。
5分後、トランスファーピペットを使用して、1Xトリカインを補充したE3で途中で皿を満たします。将来のターゲットを見つけるには、レーザースキャン共焦点顕微鏡システムの電源をオンにし、統合イメージングソフトウェアを介してレーザーを初期化します。63X プラン-アポクロマートオイル浸漬目的を選択し、水浸油をレンズに塗布します。
幼虫のロストラル面を左に向けた円形の段の挿入物で皿を固定します。明視野または差動干渉コントラスト照明を使用して、撮像用に取り付けられた幼虫の1つを選択し、フォーカスノブを使用して、カバースリップに最も近い魚の側面の皮膚を焦点にします。GFPチャネルで蛍光灯に切り替え、水平ミオセプタムに沿ってGFP発現により後方横線を見つけます。
蛍光細胞の環は神経マストマントル細胞を示し、細胞の細長鎖は神経間肥満細胞である。最初の移行プリモジウム神経マストから始めて、ステージコントロールジョイスティックを使用して、水平筋膜に沿って尾を向いて視覚的にスキャンします。第3および第4の移行プリモジウム神経マストの間の領域が到達するまで、神経間肥満細胞の文字列に続く。
複数の幼虫を画像化する場合は、最初のステージ位置を設定する位置を選択します。L3、L4領域の細胞体が特定された後、取得モードに切り替え、適切なレーザーを使用してGFPイメージングトラックをアクティブ化します。アクティブ化されたレーザー トラックに送信光チャンネルを追加するには、イメージング設定ドロップダウン メニューの T-PMT ボックスをクリックします。
ET20幼虫を画像化するには、488ナノメートルレーザーを選択し、レーザーパワーをピンホールサイズを1つの面積単位に6%、デジタルゲインを750に設定します。それ以外の場合は薄暗い投影とフィロポディアをキャプチャするために細胞体が飽和するようにゲインを調整します。フレームサイズを 1,024 x 1,024 ピクセルに設定し、平均を 2 ピクセルに、デジタルズームを 0.7 に設定します。
Z スタックボックスをオンにして、[Z 位置]ドロップダウンメニューを表示します。高速スキャン中に, インターニューロマスト細胞がちょうど焦点を合わせなくなるまで焦点を合わせ、最初のスライスを設定します。ニューロマスト細胞が再び焦点を合わせなくなるまでサンプルを通して焦点を合わせ、最後のスライスを設定します。
次に、[停止]をクリックし、[実験を開始]をクリックして、アブレーション前 Z スタックをキャプチャします。ステージ位置が追加されている場合は、position オプションを無効にして、現在の位置のみがイメージ化され、キャプチャされたファイルを保存します。ターゲット セル ボディのレーザー アブレーションの場合は、[取得インターフェイスのすべてのツールを表示] をクリックし、イメージング設定メニューで [新しいトラックの追加] を選択します。
[仕分け]をクリックし、[DAPI]を選択します。チャンネルの下で、レーザー設定に405を選択し、75%にレーザーパワーを上げる DAPI チャンネルをオフにし、候補細胞体をスキャンしてアブレーションをスキャンします。ライブをクリックし、視野の中央に神経間肥満細胞の体を持って、20〜22倍にスキャンフレームにズームインします。
セル本体が視野に入り込み、すぐにライブスキャンを停止します。405ナノメートルのレーザーシャッターボックスをチェックしてトラックをアクティブにし、45秒間タイマーを設定します。続いて、連続スキャンを有効にして、タイマーを開始します。
スキャンを45秒で直ちに停止します。アブレーション後のセル ボディのイメージングの場合、チャネル メニューで DAPI トラックをクリック解除してアブレーション レーザーを無効にし、取得モード メニューを開きます。ズームをクリックし、0.7 にズームを縮小します。
細胞切り出しの成功を評価するために、ビューのフィールドを高速スキャンします。アブレーション前のイメージングと同じ設定を使用して、アブレーション後の画像をキャプチャして保存します。送信光増倍管チャンネル画像を検査し、細胞の損傷をさらに確認します。
損傷した細胞は粒状の外観を示し、核はしばしば膨らんだり、形状が不規則に見えたりします。アブレーション後の細胞の体の回復を評価するには、タイムラプス画像キャプチャのステージ位置と時間オプションの両方をアクティブにし、時間パラメータを適切な実験時間ポイントと15分間隔に設定します。次に、実験を開始して画像を取得し、完了したら結果のファイルを保存します。
本代表的実験では、3番目と4番目の移行プリモジウム神経マストの間に位置する側線の領域を同定し、アブレーション前画像を撮影した。アブレーション後のスキャンでは、細胞体がアブレート領域に残っていないことが確認されました。隣接する神経間肥満細胞の細長い突起との間に隙間を残す。
アブレーション後の透過光増倍管チャネルの分析は、損傷および死にかけている細胞を明らかにする。腫れと不規則な形状の核と粒状の外観によってマークされています。マクロファージの可能性が高い大きなアメーバ細胞の動員も観察され得る。
この実験では、二重トランスジェニック幼虫のいくつかの細胞のアブレーションは、神経間肥満細胞の糸に大きなギャップを作り出したが、横線神経にはほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった。レーザーアブレーションの後、ギャップサイズを測定することができます。個々の神経肥満細胞の幅とアブレーションのために選択される細胞の数に応じて、わずか数ミクロンから最大100ミクロンの範囲。
アブレーション後、いくつかのインターニューロマスト細胞は、イメージングの最初の数時間以内に回復する。ギャップの閉鎖の確率がギャップサイズと負の相関を持つ。しかし、回復できない神経間肥満細胞においても、隣接する神経間肥満細胞からの長い突起の形成は、ニューロンの成長を延長することに似ている可能性があります。
T-PMTチャネルを徹底的に検査し、不規則な形状の核および粒度を示す損傷細胞を検査し、これらの細胞死指標が目に見えるようにするのに十分な時間を確保することが重要です。得られたタイムラプス顕微鏡データのさらなる分析は、レーザーアブレーションによって誘発される新しい細胞行動を明らかにする可能性があり、再生の調節因子を同定するための実験の開発を導くことができる。この技術により、これらの細胞を選択的に損傷する迅速かつ費用対効果の高い方法を提供することにより、神経間肥満細胞再生の分子調節因子を研究することができました。
