הטכניקה שאנו מציעים כאן מאפשרת לנו להתגבר על המגבלות של פרוטוקולי נגעים ידניים על ידי הפחתת נזק לרקמות סמוכות ושיפור רבייה, אפילו עבור מפעילים לא מנוסים. טכניקה זו מאפשרת לנו לבחור בדיוק היכן לגרום לנגע מבלי לפגוע ברקמות שמסביב הודות לנימי זכוכית מסתובבים בשילוב עם לייזר UV ממוקד. צעדים רבים מעורבים בהפעלת הציוד VAST, ולכן אני ממליץ לתקתק כל צעד שאתה הולך על מנת להבטיח שהכל נעשה כראוי.
התחל על ידי מרדים את הזחלים באמצעות המדיום המכיל את ההרדמה, ולאחר מכן להעביר אותם לצלחת 96-well המכילה 300 מיקרוליטרים של בינוני לבאר. הפעל את כל רכיבי המערכת כולל הלייזר לאבלציה. לאחר מכן, הפעל את הדמיית דגי הזברה האוטומטית, או תוכנת VAST, בחר צלחת בחלון הראשון ולחץ על לחצן סיים.
חלון קטן יצוץ וישאל אם הנימים ריקים ונקיים. בדוק את התמונה של נימי עבור כל בועות אוויר בפנים. אם אין בועות אוויר בפנים, לחץ על כן על החלון הקופץ.
הבא בחלון LP Sampler, עבור לתפריט קובץ ובחר באפשרות פתח סקריפט. בחר קובץ המכיל את קובץ ה- Script המתאים לניסוי שיש לבצע. לאחר מכן, בחלון התוכנה הראשי של VAST, עבור אל קובץ ובחר פתח ניסוי.
בחר את קובץ הניסוי המתאים לניסוי המתוכנן. הפעל את תוכנת ImageJ/Fiji, עבור לתפריט קובץ ובחר סקריפט חדש כדי לפתוח את חלון הסקריפט. לאחר מכן, עבור לתפריט קובץ ובחר פתח כדי לטעון את סקריפט נגע הלייזר.
לאחר מכן, כדי להפעיל את Python IDE, עבור לתפריט קובץ ובחר פתח קובץ כדי לטעון את קובץ ה- Script כדי לנהל את הלייזר. לאחר מכן, לחץ על תפריט הפעלה ובחר הפעל ללא איתור באגים כדי להפעיל את קובץ ה- Script. ודא כי רצף של הודעות בחלונית המסוף מופיע יחד עם רעש מסוים בעת אתחול מנחת הלייזר.
בחלון הראשי של תוכנת VAST, לחץ על כפתורי החצים כדי להזיז את הבמה ולרכז את הנימים ביחס למטרת המיקרוסקופ. הבט דרך העיניים והתמקד בחלק העליון של הנימים באמצעות האור המועבר של המיקרוסקופ. מניחים צלחת 96-well המכיל את הזחלים על מחזיק הצלחת השמאלית של סמפלר LP.
לאחר מכן, הנח צלחת נוספת לאיסוף על מחזיק הצלחת הימני של הסמפלר. ודא כי באר A1 של הצלחת נמצאת בפינה השמאלית הקדמית של המחזיק. בחלון LP סמפלר של תוכנת VAST, לחץ על כפתור תבנית צלחת ובחר את כל הבארות המכילות זחלים.
לחץ על לחצן אישור כדי לאמת ולסגור את החלון. לאחר מכן, לחץ על לחצן לוחית הפעלה בחלון סמפלר LP כדי להתחיל לטעון את הזחל. לאחר מכן, עבור אל תוכנת המיקרוסקופ ולחץ על לחצן Live כדי לדמיין את הזחל.
הפעל את ידית המיקוד של המיקרוסקופ עד שהתעלה המרכזית של חוט השדרה נראית לעין. צלם תמונה בפלואורסצנטיות ושמור את התמונה בתיקיה. פתחו את התמונה ב-ImageJ והתאמו את החדות במידת הצורך.
לחץ על כלי קו אזור העניין וצייר קו קצר שבמרכזו חוט השדרה. העבר את המיקרוסקופ למיקום מראה רפלקטיבי של 100%. טען את סקריפט ImageJ והגדר חזרה ל- 2, מדגם ל- 1, רוחב ל- 40 מיקרון והנחתה ל- 89.
לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על לחצן אישור. לאחר סיום רצף צילומי הלייזר, עבור להדמיית פלואורסצנטיות בתוכנת ההדמיה והתאם את המוקד. קח תמונה חדשה ושמור אותה.
פתח תמונה חדשה זו ב- ImageJ וצייר קו חדש גדול יותר מחוט השדרה עצמו. העבר את המיקרוסקופ למיקום מראה רפלקטיבי של 100%. עבור אל חלון הסקריפט ImageJ והגדר את החזרה ל- 2, לדוגמה ל- 1, רוחב ל- 40 מיקרון והנחתה ל- 89.
לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על לחצן אישור. כאשר רצף צילומי הלייזר מסתיים, ודא את איכות ההעברה על-ידי הדמיית פלואורסצנטיות ומיקוד. ודא שאף תאים או אקסונים לא יישארו שלמים באתר הנגע.
עבור אל חלון התוכנה הראשי VAST ולחץ על כפתור איסוף כדי לאסוף את הזחלים הנגעים לתוך צלחת ריקה 96-well. לאחר מכן, לחץ על נורית מגש תיבת הסימון כדי להפעיל שוב את נורית המערכת VAST. מוציאים את הזחל מצלחת 96 הבארות בהקדם האפשרי, ומעבירים אותם לצלחת פטרי נקייה עם מי דגים טריים לזחל כדי להתאושש לאחר הנגע.
שים את צלחת פטרי באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס. אצטילציה טובולין אימונו-כתמים והדמיה סידן עולה כי נגע לייזר משבש לחלוטין את ההמשכיות של רקמת עמוד השדרה. חוט שדרה שלם מוצג בתמונה זו.
הפרעה מוחלטת של האקסונים בין הצדדים הקואודליים והרוסטרליים של הנגע מאשרת את ההעברה המלאה של חוט השדרה. דוגמה להעברה לא שלמה מוצגת כאן. חוט השדרה חוצה על זחל NBTG cAMP 6-S מוצג בתמונה זו.
המלבנים מראים את החזרי ההשקעה המשמשים לכימות עוצמת הפלואורסצנטיות בצדדים הרוסטרליים והקאודליים של הנגעים. התמונה הגרפית מייצגת את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן ב- ROSTRAL ו- roaudal analysis ROIs. תמונות הפלואורסצנטיות של הקרנת ההקרנה בעוצמה המרבית של זחל NBT:dsRed לפני נגע הלייזר, לאחר שלוש שעות, 24 שעות ו -48 שעות של נגע הלייזר מוצגות כאן.
לאחר 24 שעות לאחר הפציעה, הפצעים החלו להיסגר, מה שהוביל לשיקום חלקי של המבנה הראשוני של חוט השדרה לאחר 48 שעות. חיבור תפקודי חלקי אושר לאחר 48 שעות לאחר הפציעה באמצעות הדמיית סידן. היחס בין משרעת הקוצים באזור caudal לבין אזור rostral הראה עלייה בין 3, 24, ו 48 שעות לאחר הפציעה.
גיוס מקרופאג נצפתה לאחר נגעים בלייזר באמצעות NBT:dsRed mpeg1 GFP נגעי לייזר זחלים. לא נצפתה הבדל במספר התאים המסומנים בין נגעים ידניים ללייזר. דגים ללא נגע הציגו פחות תאים בעלי תווית כפולה מאשר דגים נגועים בשני תנאי הנגע.
נגע בלייזר גורם פחות נזק לשרירים ולעור מאשר נגע ידני. זה קריטי כדי לוודא אם הנגע הושלם או לא. אין לראות תא או מבנה שלם באזור הנגע, רק רקע עמום.
כדי לחקור התחדשות חוט השדרה, אנו משתמשים בשיטות רבות, כולל אימונו-היסטוכימיה והדמיה סידן. חשוב לציין, אנחנו יכולים גם לעשות אלקטרופיזיולוגיה, כמו הרקמה יכולה לעמוד בחתך, בניגוד לבעלי חיים נגועים באופן ידני. טכניקה חדשה זו מאפשרת לנו ללמוד כמותית את ארגון הרקמות המבניות והתפקודיות בחוט השדרה לאחר פציעה על ידי מתן אפשרות לנגעים הניתנים לשחזור ומבוקרים.
