Usando este protocolo, qualquer laboratório que tenha um microscópio confocal padrão equipado com um laser de 405 nanômetros pode executar ablações a laser progenitoras de células ciliadas e monitorar sua regeneração. Ao contrário da eletro-ablação, esta técnica limita os danos às células circundantes e é mais acessível do que uma poderosa configuração de laser UV pulsado. As imagens confocal também podem ser realizadas imediatamente antes e depois da ablação.
Essa técnica nos permite compreender melhor o comportamento regenerativo dos progenitores sensoriais, o que pode ajudar no desenvolvimento de terapias para perda auditiva humana. Para montagem, primeira pipeta de três a quatro larvas de anestesia em uma pequena gota de solução tricaina E3 no centro da antena de 35 milímetros, com um fundo de deslizamento de cobertura de 14 milímetros número 1,5. Remova a solução em excesso para que as larvas permaneçam em uma pequena gota grande o suficiente para contê-las.
E coloque o prato no palco de um microscópio estéreo binóculo. Manipule o zoom e o foco para que todas as larvas estejam no campo de visão e use uma pipeta de transferência para adicionar uma fina camada de agro-solução ao deslizamento da tampa. Retire o excesso de agros até que o líquido apenas encha o poço na parte inferior do prato, tomando cuidado para não aspirar nenhuma larva.
E use uma faca de cabelo para orientar rapidamente as larvas na agro-solução com o lado rostral virado para a esquerda. Pressione suavemente as larvas contra o vidro, de tal forma que as larvas se deitem no perfil com os lados direito voltados para baixo. Após cerca de 60 segundos, os agros começarão a se solidificar e as larvas não poderão ser reorientadas.
Após cinco minutos, use uma pipeta de transferência para encher o prato no meio do caminho com e3 suplementado com tricaine 1X. Para localizar alvos prospectivos, ligue a energia para o sistema de microscopia confocal de varredura a laser e inicialize o laser através do software de imagem integrado. Selecione o objetivo de imersão de óleo plan-apochromat 63X e aplique óleo de imersão na lente.
Fixar o prato em uma inserção de estágio circular com o aspecto rostral das larvas voltadas para a esquerda. Usando a iluminação de contraste de campo brilhante ou interferência diferencial, selecione uma das larvas montadas para imagem e use o botão de foco para colocar a pele na lateral do peixe mais próxima da tampa em foco. Mude para iluminação epifluorescente no canal GFP e localize a linha lateral posterior pela expressão GFP ao longo do myoseptum horizontal.
Anéis de células fluorescentes são indicativos das células de manto neuromass e fios alongados das células são as células interneuromast. Começando com o primeiro neuromast primordium migratório, use o joystick de controle de palco para digitalizar visualmente caudally ao longo do myoseptum horizontal. Seguindo a cadeia de células interneuromast até que a região entre o terceiro e quarto neuromasts de primordium migratório seja atingida.
Se várias larvas forem imagens, selecione a posição para definir a posição do primeiro estágio. Após corpos celulares na região L3, A região L4 foi identificada, mudar para o modo de aquisição e usar um laser apropriado para ativar a faixa de imagem GFP. Para adicionar um canal de luz transmitido à faixa laser ativada, clique na caixa T-PMT no menu suspenso da configuração de imagem.
Para imaginar as larvas ET20, selecione o laser de 488 nanômetros, defina a potência laser para 6% do tamanho do pinhole para uma unidade de área equivalente e o ganho digital para 750. Ajuste os ganhos de tal forma que os corpos celulares estejam saturados para capturar projeções fracas e filopodia. E definir o tamanho do quadro para 1.024 por 1.024 pixels, a média para dois e o zoom digital para 0,7.
Verifique a caixa de pilha Z para trazer o menu suspenso da posição Z. Enquanto estiver em rápida varredura, concentre-se até que as células interneuromast estejam fora de foco e defina a primeira fatia. Concentre-se através da amostra até que as células interneuromast estejam novamente fora de foco e definir a última fatia.
Em seguida, clique em parar e clique em iniciar o experimento para capturar uma pilha Z de pré-ablação. Se as posições de estágio tiverem sido adicionadas, inative a opção de posições para que apenas a posição atual seja visualizada e salve o arquivo uma vez que ele tenha sido capturado. Para ablação a laser dos corpos celulares direcionados, clique em mostrar todas as ferramentas na interface de aquisição e no menu de configuração de imagem, selecione adicionar uma nova faixa.
Clique em corante e selecione DAPI. Nos canais, selecione 405 para a configuração do laser e aumente a potência do laser para 75% Desapegue o canal DAPI para desligar o laser enquanto procura corpos de células candidatos para ablação. Clique ao vivo e com o corpo de uma célula interneuromast centrada no campo de visão, amplie o quadro de digitalização para 20 a 22X.
Pare a varredura ao vivo assim que o corpo da célula preencher o campo de visão. Verifique a caixa do obturador laser de 405 nanômetros para ativar a faixa e defina um temporizador por 45 segundos. Em seguida, ative a varredura contínua e inicie o temporizador.
Imediatamente parando a varredura em 45 segundos. Para a imagem dos corpos celulares após ablação, sob o menu de canais, desacarule a faixa DAPI para inativar o laser de ablação e abrir o menu do modo de aquisição. Clique em zoom e diminua o zoom para 0,7.
Para avaliar o sucesso da ablação celular, escaneie rapidamente o campo de visão. Usando as mesmas configurações que as da imagem pré-ablação, capture e salve uma imagem pós-ablação. Inspecione a imagem do tubo fotomultiplier de luz transmitida para confirmar ainda mais o dano celular.
As células danificadas demonstrarão uma aparência granular e os núcleos frequentemente incharão ou parecerão irregulares em forma. Para avaliar a recuperação do corpo do corpo da célula pós-ablação, ative as opções de posição de estágio e tempo para captura de imagem com lapso de tempo e defina os parâmetros de tempo para o ponto de tempo experimental apropriado e intervalos de 15 minutos. Em seguida, inicie o experimento para adquirir imagens e salve o arquivo resultante quando concluído.
Neste experimento representativo, foi identificada a região da linha lateral localizada entre o terceiro e quarto neuromasts de primordium migratório e foram capturadas imagens de pré-ablação. A varredura pós-ablação confirmou que nenhum corpo celular permaneceu na região ablada. Deixando uma lacuna entre as projeções alongadas das células interneuromast adjacentes.
A análise do tubo fotomultiplier de luz transmitida após a ablação, revela células danificadas e moribundas. Marcado por núcleos inchados e irregularmente moldados e uma aparência granular. O recrutamento de grandes células amoebóides que são provavelmente macrófagos também pode ser observado.
Neste experimento, a ablação de várias células nas larvas transgênicas duplas criou lacunas consideráveis na corda das células interneuromast, mas teve pouco ou nenhum efeito no nervo da linha lateral. Após a ablação a laser, tamanhos de lacuna podem ser medidos. Variando de apenas alguns mícrons até 100 mícrons, dependendo da largura que as células neuromass individuais e quantas células são selecionadas para ablação.
Após a ablação, algumas células interneuromast se recuperam nas primeiras horas de imagem. Com a probabilidade de fechamento de lacunas se correlacionando negativamente com o tamanho da lacuna. Mesmo em células interneuromast que não conseguem se recuperar, no entanto, a formação de projeções longas de células interneuromast vizinhas, que podem se assemelhar a cones de crescimento neuronal extensão pode ser observada.
É importante inspecionar minuciosamente o canal T-PMT para que as células danificadas execerem núcleos e granularidade em forma irregular, e para permitir tempo suficiente para que esses indicadores de morte celular se tornem visíveis. Uma análise mais aprofundada dos dados de microscopia de lapso de tempo resultantes pode potencialmente revelar novos comportamentos celulares induzidos pela ablação a laser e pode guiar o desenvolvimento de experimentos para identificar reguladores de regeneração. Esta técnica nos permitiu estudar os reguladores moleculares da regeneração celular interneuromast fornecendo um método rápido e econômico para danificar seletivamente essas células.
