Usando este protocolo, cualquier laboratorio que tenga un microscopio confocal estándar equipado con un láser de 405 nanómetros puede realizar ablaciones láser progenitoras de células capilares y monitorear su regeneración. A diferencia de la electroablación, esta técnica limita los daños que dañan las células circundantes y es más accesible que una potente configuración láser UV pulsada. Las imágenes confocales también se pueden realizar inmediatamente antes y después de la ablación.
Esta técnica nos permite comprender mejor el comportamiento regenerativo de los progenitores sensoriales, lo que puede ayudar en el desarrollo de terapias para la pérdida auditiva humana. Para el montaje, primero pipetear tres a cuatro anestesifica larvas en una pequeña gota de solución de tricaína E3 en el centro de la placa de 35 milímetros, con un fondo de cubierta de 14 milímetros 1.5. Retire el exceso de solución para que las larvas permanezcan en una gota pequeña lo suficientemente grande como para contenerlas.
Y coloque el plato en el escenario de un microscopio estereomático binocular. Manipule el zoom y el enfoque para que todas las larvas estén en el campo de visión y utilice una pipeta de transferencia para agregar una fina capa de agrocontrasión en el resbalón de la cubierta. Retire el exceso de agros hasta que el líquido se llene el pozo en la parte inferior del plato, teniendo cuidado de no aspirar ninguna larva.
Y usa un cuchillo para el cabello para orientar rápidamente las larvas en la agro-solución con el lado rostral orientado hacia la izquierda. Presione suavemente las larvas contra el vidrio, de manera que las larvas estén en el perfil con sus lados derecho hacia abajo. Después de unos 60 segundos, los agros comenzarán a solidificarse y las larvas no podrán ser reorientadas.
Después de cinco minutos, utilice una pipeta de transferencia para llenar el plato a mitad de camino con E3 complementado con 1X tricaína. Para localizar objetivos prospectivos, encienda el sistema de microscopía confocal de escaneo láser e inicialice el láser a través del software de imágenes integrado. Seleccione el objetivo de inmersión en aceite 63X Plan-Apochromat y aplique aceite de inmersión a la lente.
Asegurar el plato en un inserto de etapa circular con el aspecto rostral de las larvas mirando hacia la izquierda. Mediante la iluminación de contraste de interferencia diferencial o de campo brillante, seleccione una de las larvas montadas para la toma de imágenes y utilice la perilla de enfoque para enfocar la piel en el lado del pez más cercana al resbalón de la cubierta. Cambie a la iluminación epifluorescente en el canal GFP y localice la línea lateral posterior mediante la expresión GFP a lo largo del mioseptum horizontal.
Los anillos de células fluorescentes son indicativos de las células del manto neuromast y las hebras alargadas de las células son las células interneuromas. Comenzando con el primer neuromast primordium migratorio, utilice el joystick de control de escenario para escanear visualmente caudalmente a lo largo del mioseptum horizontal. Siguiendo la cadena de células interneuromas hasta que se alcanza la región entre el tercer y el cuarto neuromasts primordium migratorio.
Si se van a tomar imágenes de varias larvas, seleccione la posición para establecer la primera posición de la etapa. Una vez identificados los cuerpos celulares en la región L3, L4, cambie al modo de adquisición y utilice un láser adecuado para activar la pista de imágenes GFP. Para agregar un canal de luz transmitido a la pista láser activada, haga clic en el cuadro T-PMT del menú desplegable configuración de imágenes.
Para crear imágenes de larvas ET20, seleccione el láser de 488 nanómetros, establezca la potencia del láser en 6%el tamaño del agujero en un equivalente de unidad de área y la ganancia digital en 750. Ajuste las ganancias de tal manera que los cuerpos celulares estén saturados para capturar proyecciones tenues y filopodia. Y establezca el tamaño del fotograma en 1, 024 por 1, 024 píxeles, el promedio a dos y el zoom digital a 0.7.
Marque la casilla de la pila Z para abrir el menú desplegable de la posición Z. Mientras escanea rápidamente, concéntrate hasta que las células interneuromas estén desenfocadas y establece la primera rebanada. Concéntrese a través de la muestra hasta que las células interneuromas estén desenfocadas una vez más y establezca la última rebanada.
A continuación, haga clic en detener y haga clic en Iniciar experimento para capturar una pila Z previa a la ablación. Si se han añadido las posiciones de etapa, desactive la opción de posiciones para que solo se imagine la posición actual y guarde el archivo una vez que se haya capturado. Para la ablación láser de los cuerpos de celda de destino, haga clic en Mostrar todas las herramientas en la interfaz de adquisición y, en el menú de configuración de imágenes, seleccione Agregar una nueva pista.
Haga clic en tinte y seleccione DAPI. En Canales, seleccione 405 para el ajuste láser y aumente la potencia del láser al 75% Haga clic en el canal DAPI para apagar el láser mientras busca cuerpos celulares candidatos para la ablación. Haga clic en vivo y con el cuerpo de una celda interneuromast centrada en el campo de visión, haga zoom en el marco de escaneo a 20 a 22X.
Detenga el escaneo en vivo tan pronto como el cuerpo de la celda llene el campo de visión. Marque la caja del obturador láser de 405 nanómetros para activar la pista y ajuste un temporizador durante 45 segundos. A continuación, active el escaneo continuo e inicie el temporizador.
Detenga inmediatamente el escaneo a los 45 segundos. Para obtener imágenes de los cuerpos celulares después de la ablación, en el menú de canales, desactive la pista DAPI para desactivar el láser de ablación y abra el menú del modo de adquisición. Haga clic en zoom y disminuya el zoom a 0,7.
Para evaluar el éxito de la ablación celular, escanee rápidamente el campo de visión. Utilizando la misma configuración que la de la imagen previa a la ablación, capture y guarde una imagen posterior a la ablación. Inspeccione la imagen del canal del tubo fotomultiplicador de luz transmitida para confirmar aún más el daño celular.
Las células dañadas demostrarán una apariencia granular y los núcleos con frecuencia se hinchan o aparecen de forma irregular. Para evaluar la recuperación del cuerpo de la célula posterior a la ablación, active las opciones de posición de la etapa y de tiempo para la captura de imágenes de lapso de tiempo y establezca los parámetros de tiempo en el punto de tiempo experimental adecuado y en los intervalos de 15 minutos. A continuación, inicie el experimento para adquirir imágenes y guarde el archivo resultante cuando haya finalizado.
En este experimento representativo, se identificó la región de la línea lateral situada entre el tercer y el cuarto neuromasta primoridio migratorio y se capturaron imágenes previas a la ablación. La exploración posterior a la ablación confirmó que no quedaban cuerpos celulares en la región ablada. Dejando un hueco entre las proyecciones alargadas de las células interneuromas adyacentes.
El análisis del canal de tubo fotomultiplicador de luz transmitida después de la ablación, revela células dañadas y moribundas. Marcado por núcleos hinchados y de forma irregular y una apariencia granular. También se puede observar el reclutamiento de grandes células amoeboides que probablemente sean macrófagos.
En este experimento, la ablación de varias células en las larvas transgénicas dobles creó brechas considerables en la cadena de las células interneuromas, pero tuvo poco o ningún efecto en el nervio de línea lateral. Después de la ablación láser, se pueden medir los tamaños de separación. Desde unas pocas micras hasta 100 micras, dependiendo del ancho que las células neuromasmas individuales y cuántas células se seleccionan para la ablación.
Después de la ablación, algunas células interneuromast se recuperan dentro de las primeras horas de la toma de imágenes. Con la probabilidad de cierre de brecha correlacionado negativamente con el tamaño de la brecha. Incluso en las células interneuromas que son incapaces de recuperarse sin embargo, se puede observar la formación de proyecciones largas de las células interneuromas vecinas, que pueden parecerse a la extensión de los conos de crecimiento neuronal.
Es importante inspeccionar a fondo el canal T-PMT en busca de células dañadas que presenten núcleos y granularidad de forma irregular, y que se permita tiempo suficiente para que estos indicadores de muerte celular se vuelvan visibles. Un análisis posterior de los datos resultantes de la microscopía de lapso de tiempo, puede revelar potencialmente nuevos comportamientos celulares inducidos por la ablación láser y puede guiar el desarrollo de experimentos para identificar reguladores de regeneración. Esta técnica nos ha permitido estudiar los reguladores moleculares de la regeneración celular interneuromas proporcionando un método rápido y rentable para dañar selectivamente estas células.
