이 프로토콜을 사용하여 405 나노미터 레이저가 장착된 표준 공초점 현미경이 있는 모든 실험실은 모발 세포 전구 레이저 절제를 수행하고 재생을 모니터링할 수 있습니다. 전기 절제와 는 달리,이 기술은 주변 세포를 손상제한하고 강력한 펄스 UV 레이저 설정보다 더 접근 할 수 있습니다. 공초점 화상 진찰은 또한 절제 의 전후에 수행될 수 있습니다.
이 기술은 인간 청력 감소를 위한 치료의 발달에 도움이 될 수 있는 감각 선조의 재생 행동을 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 장착을 위해, 첫 번째 파이펫은 35밀리미터 접시의 중앙에 E3 트리카인 용액의 작은 방울로 애벌레를 3~ 4 개의 마취, 14 밀리미터 번호 1.5 커버 슬립 바닥. 여분의 용액을 제거하여 애벌레가 그들을 포함 할 만큼 충분히 큰 작은 물방울에 남아 있도록.
그리고 쌍안경 스테레오 현미경의 무대에 접시를 배치합니다. 줌 및 포커스를 조작하여 모든 애벌레가 시야에 있고 이송 파이펫을 사용하여 커버 슬립에 농약 용액의 얇은 층을 추가합니다. 액체가 접시 바닥의 우물을 채울 때까지 여분의 농을 제거하여 애벌레를 흡입하지 않도록주의하십시오.
그리고 머리 칼을 사용하여 왼쪽을 향한 로스트랄 면으로 농약용의 애벌레를 빠르게 방향을 지정합니다. 애벌레를 유리에 부드럽게 눌러 오른쪽 면을 향한 프로필에 유충이 놓여 있습니다. 약 60초 후에 농가가 굳어지기 시작하고 애벌레는 방향을 바글 수 없습니다.
5분 후, 1X 트리카인으로 보충된 E3로 접시를 반쯤 채우는 이송 파이펫을 사용한다. 잠재 대상을 찾으려면 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템에 전원을 켜고 통합 이미징 소프트웨어를 통해 레이저를 초기화하십시오. 63X 플랜-아포크로마트 오일 침지 목표를 선택하고 렌즈에 침지 오일을 적용합니다.
왼쪽을 향한 애벌레의 로스트랄 측면으로 원형 스테이지 인서트에서 접시를 고정합니다. 밝은 필드 또는 차동 간섭 대조 조명을 사용하여, 이미징을 위해 장착 된 애벌레 중 하나를 선택하고 초점 손잡이를 사용하여 커버에 가장 가까운 물고기의 측면에 피부를 초점으로 미끄러. GFP 채널에서 상피 형광 조명으로 전환하고 수평 심술을 따라 GFP 발현에 의해 후방 측면 선을 찾습니다.
형광 세포의 고리는 신경종 세포와 세포의 길쭉한 가닥을 나타내는 것은 신경종 세포입니다. 첫 번째 마이그레이션 프리모듐 신경 종으로 시작, 시각적으로 수평 심근을 따라 caudally 스캔 하는 단계 제어 조이스틱을 사용 하 여. 제 3 및 네 번째 이주 프리모듐 신경종 사이의 영역까지 신경 마비 세포의 문자열을 따라 도달한다.
여러 애벌레를 이미지화하려면 위치를 선택하여 첫 번째 단계 위치를 설정합니다. L3내의 세포체 후, L4 영역이 확인되어 획득 모드로 전환하고 적절한 레이저를 사용하여 GFP 이미징 트랙을 활성화한다. 활성화된 레이저 트랙에 전송된 라이트 채널을 추가하려면 이미징 설정 드롭다운 메뉴에서 T-PMT 상자를 클릭합니다.
ET20 애벌레를 이미지하기 위해 488 나노미터 레이저를 선택하고, 레이저 전력을 핀홀 크기를 한 영역 단위로 6%로 설정하고 디지털 게인을 750으로 설정한다. 세포 체가 포화되어 그렇지 않으면 희미한 투영 및 filopodia를 캡처하도록 이득을 조정합니다. 그리고 프레임 크기를 1, 024 x 1, 024 픽셀로 설정하고 평균을 2픽셀로 설정하고 디지털 줌을 0.7로 설정합니다.
Z 스택 상자를 선택하여 Z 위치 드롭다운 메뉴를 가져옵니다. 빠른 스캐닝하는 동안 신경마비세포가 초점이 바워질 때까지 초점을 맞추고 첫 번째 슬라이스를 설정합니다. 신경마비세포가 다시 한 번 초점을 맞추고 마지막 슬라이스를 설정할 때까지 샘플을 통해 집중하십시오.
그런 다음 중지를 클릭하고 실험을 클릭하여 절제 전 Z 스택을 캡처합니다. 스테이지 위치가 추가된 경우 현재 위치만 이미지화되도록 위치 옵션을 비활성화하고 캡처된 후에 파일을 저장합니다. 표적 셀 바디의 레이저 절제의 경우, 획득 인터페이스와 이미징 설정 메뉴의 모든 도구를 표시하려면 새 트랙을 추가하십시오.
염료를 클릭하고 DAPI를 선택합니다. 채널에서 레이저 설정에 대해 405를 선택하고 레이저 전력을 75%로 늘려 DAPI 채널을 클릭취소하여 레이저를 끄고 절제를 위해 후보 셀 바디를 스캔합니다. 시야를 중심으로 한 신경질 세포의 본체를 사용하여 라이브를 클릭하고 스캔 프레임을 20~22X로 확대합니다.
셀 바디가 시야를 채우는 즉시 라이브 스캐닝을 중지합니다. 405 나노미터 레이저 셔터 박스를 확인하여 트랙을 활성화하고 타이머를 45초 동안 설정합니다. 그런 다음 연속 스캐닝을 활성화하고 타이머를 시작합니다.
즉시 45초에 스캔을 중지합니다. 절제 후 셀 바디의 이미징을 보려면 채널 메뉴에서 DAPI 트랙을 클릭하여 절제 레이저를 비활성화하고 획득 모드 메뉴를 엽니다. 확대/축소를 클릭하고 확대/축소를 0.7로 줄입니다.
세포 절제의 성공을 평가하기 위해 시야를 빠르게 스캔합니다. 절제 전 이미징에 대해 동일한 설정을 사용하여 절제 후 이미지를 캡처하고 저장합니다. 전송된 광증 튜브 채널 이미지를 검사하여 세포 손상을 더욱 확인합니다.
손상된 세포는 과립 된 외관을 보여주고 핵은 자주 팽창하거나 모양에 불규칙하게 나타납니다. 절제 후 세포 체방 복구를 평가하기 위해 시간 경과 이미지 캡처를 위한 스테이지 위치 및 시간 옵션을 모두 활성화하고 시간 매개 변수를 적절한 실험 시간 지점 및 15분 간격으로 설정합니다. 그런 다음 실험을 시작하여 이미지를 획득하고 완료되면 결과 파일을 저장합니다.
본 대표적인 실험에서, 제3및 제4이주 원시신경종 사이에 위치한 측면선의 영역이 확인되었고 절제 전 이미지가 포착되었다. 절제 후 스캔은 압착 된 지역에 남아있는 세포 시체가 없음을 확인했습니다. 인접한 신경 종세포의 길쭉한 투영 사이의 간격을 둡니다.
절제 후 전달된 광증 튜브 채널의 분석은 손상되고 죽어가는 세포를 드러낸다. 부어 오르고 불규칙하게 모양의 핵과 세분화된 모양으로 표시되어 있습니다. 대식세포가 큰 아모에이드 세포의 모집도 관찰될 수 있다.
이 실험에서 이중 형질전환 애벌레에 있는 몇몇 세포의 절제는 신경종 세포 문자열에 있는 상당한 간격을 생성했습니다, 그러나 측면 선 신경에 거의 또는 전혀 효력이 없었습니다. 레이저 절제 에 이어 갭 크기를 측정할 수 있습니다. 개별 신경종 세포가 절제를 위해 선택되는 넓이에 따라 단지 몇 미크론에서 100 미크론까지 에 구역 수색합니다.
절제 후, 일부 신경 종 세포 는 이미징의 처음 몇 시간 이내에 복구. 갭 클로저의 확률로 갭 크기와 부정적인 상관 관계가 있습니다. 그러나 복구할 수 없는 신경마비세포에서도, 신경성장 콘을 확장하는 것과 유사할 수 있는 인접한 신경근세포로부터긴 돌전의 형성을 관찰할 수 있다.
불규칙하게 형성된 핵과 세분성을 나타내는 손상된 세포에 대한 T-PMT 채널을 철저히 검사하고, 세포 사멸의 이러한 지표가 눈에 띄게 되기에 충분한 시간을 허용하는 것이 중요합니다. 결과 시간 경과 현미경 데이터의 추가 분석은 레이저 절제에 의해 유도된 새로운 세포 행동을 잠재적으로 드러낼 수 있고 재생의 레귤레이터를 식별하기 위한 실험의 발달을 안내할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 선택적으로 이 세포를 손상하기 위한 신속하고 비용 효과적인 방법을 제공함으로써 신경종 세포 재생의 분자 조절기를 연구하는 가능하게 했습니다.
