אנו מתארים כאן זרימת עבודה פשוטה מבוססת פיג'י opensource בשם תולעת ליישר, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור מונטאז'ים בודדים או רב ערוציים של תולעים מיושר עניין מתמונות מיקרוסקופיות גלם. מכיוון שזרימת עבודה זו מסתמכת על בעלי חיים נבחרים של משתמשים בעלי עניין, היא עשויה להיות שימושית במיוחד בעת ניתוח תמונות מ- C.elegans שבהן התולעים אינן כולן בשלב או במצב הנכון. יש לציין כי הפלט של תולעת ליישר יכול לשמש לכימות הבאים של פלואורסצנטיות עם פיג'י או תוכנה אחרת לניתוח תמונה.
כאן אנו מדגימים כימות פלואורסצנטיות באמצעות צינור CellProfiler Worm_CP. בגין על ידי יצירת מיקרופייפאט פה על ידי הרחבת נימי זכוכית דק בלהבה של מבער בונזן. לאחר הארכה בלהבה, לשבור את נימי לשני חלקים אם זה לא לשבור לשני חלקים לאחר הארכה.
אם זה פרץ לשתי חתיכות, לחתוך את הסוף של הארוך ביותר. בחר את החתיכה הארוכה יותר ובדוק אם נימי פתוח על ידי ניסיון לשאפת מים. נתק את המתאם מצינור סיליקון באורך 3 מ"מ.
חבר את נימי הזכוכית למתאם נימי המקושר לצינור סיליקון באורך שישה מילימטרים. ואז לחבר את הקצה השני של צינור שישה מילימטר לתוך מסנן 0.2 מיקרומטר וצינור סיליקון שלושה מילימטר בקצה השני שלה. חבר קצה מסנן מילימטר אחד לקצה החופשי של צינור הסיליקון שלושה מילימטר כדי לשאוף נוזל.
תחת מיקרוסקופ ניתוח, להסיר נוזלים רבים ככל האפשר סביב גלולה של תולעים קבועות עם micropipette הפה. הוסף במהירות 10 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לתחתית הצינור. יש לשטוף קצה של 10 מיקרוליטר ב-PBS עם עקבות של חומר ניקוי כדי למנוע מתולעים להידבק לצדדים של קצה פיפטה מפלסטיק.
ואז לחתוך את הקצה של הקצה עם זוג מספריים. מעבירים שמונה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה עם התולעים על משטח אגרוז שהוכן בעבר. תוך כדי התבוננות בשקופית מתחת למיקרוסקופ, התסיסו אותה בעדינות כדי למנוע חפיפה של התולעים.
ואז לכסות את טיפת מדיום הרכבה על כרית אגרוז עם כיסוי 18 על 18 מילימטר. כדי לעלות על תולעים חיות, פיפטה שלושה עד ארבעה מיקרוליטרים של שלושה levamisole מילימולרי נמס M9 על כרית אגרוז. בחר 30 עד 50 תולעים לכל תנאי לתוך טיפת levamisole.
לאחר מכן לכסות את הירידה עם כיסוי 18 על 18 מילימטר ותמונה התולעים בתוך שעה אחת. התקן את חבילת התוכנה לניתוח תמונות קוד פתוח פיג'י מ- ImageJ, או אם היא כבר מותקנת במחשב, ודא שגירסה 1.52A או גירסה מתקדמת יותר, ולאחר מכן הורד את המאגר ליישור תולעים מ- GitHub ושמור אותו במחשב. לאחר שכל רכיבי הצינור הורדו והותקנו, פתח את פיג'י והפעל את המאקרו יישור התולעת על-ידי לחיצה על תוספים, פקודות מאקרו והפעלה שורת התפריטים הראשית.
אתר את יישור התולעת. ijm סקריפט ולחץ על פתוח. נווט אל תיקיית הקלט עם התמונות שיש לנתח ולחץ על בחר, ודא שהתיקיה שנבחרה מכילה קבצי תמונה בלבד.
המאקרו ייצור באופן אוטומטי תיקיית פלט שבה יישמרו כל התוצאות. שם התיקיה יהיה זהה לתיקיית הקלט עם פלט כמו לאחר התיקון. אפשר למאקרו לפתוח את התמונה הראשונה תיקיית הקלט ולהשתמש בה כתמונה מייצגת כדי לחלץ את ההגדרות הדרושות ליצירת המונטאז', כולל רוחב התולעים, הבהירות והניגודיות.
באמצעות כלי ציור הקו הישר, צייר קו לרוחב תולעת ולחץ על אישור. השתמש באורך שורה זו כדי לקבוע את גובה האזורים החתוכים עבור תולעים בודדות. עבור כל ערוץ, ציין את השם, טבלת בדיקת המידע ואם יש לכלול אותו במונטאז', ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, התאימו את הגדרות הבהירות והניגודיות של הערוצים בעזרת המחוונים. חזור על תהליך זה עבור הערוצים הנותרים.
לאחר שתצורת כל ההגדרות נקבעה, הן יוקלטו בטבלת הגדרות ויישמרו בתיקיה המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט. תמונה נוצרת כדי להראות איך ייראו כל התמונות לאחר יישום ההגדרות. אם התמונה משביעת רצון, סמן את התיבה העליונה.
התיבה השנייה והשלישית של החלונית 'בדוק את כל ההגדרות' מציינות את האפשרויות לדור מונטאז'. השאר את שתי התיבות מסומנות ולחץ על אישור כדי לבצע את שאר המאקרו. כשל בניג המותר העליון יגרום למאקרו להתנין מחדש את תוכנית ההתקנה.
לאחר מכן המאקרו ממשיך לפתוח את כל התמונות תיקיית הקלט. עבור כל תמונה, צייר קווים על ציר האורך של כל התולעים שייכללו במונטאז' באמצעות כלי הקו מקולח או חופשי. צייר קווים באופן עקבי מכף יד לזנב או להיפך לאורך המלא של התולעים והוסף כל שורה למנהל החזר ההשקעות על-ידי לחיצה על Control T.Once שנוספו כל התולעים הרצויות, לחץ על אישור. לאחר מכן, יישור תולעים ייצור תמונות חתוכה של תולעים בודדות שנבחרו, אשר יישמרו בתת-תיקיית התולעת הבודדת של תיקיית הפלט.
מונטאז'ים של כל התולעים שנבחרו יישמרו בתיקיה המיושרת. הורד והתקן את CellProfiler 2.2.0 על-ידי לחיצה על הקישור עבור מהדורות CellProfiler קודמות בדף ההורדה ובחירת מערכת ההפעלה הדרושה. לפני הפעלת Worm_CP, ודא שכל תמונות הפלט הצפויות נמצאות בתיקיות המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט יישור תולעת.
עותק מעובד של התמונה המקורית, מסיכת תמונה בינארית של אוכלוסיית התולעים, יישור מסיכה אם הקו מצויר על תולעים נבחרות ותמונה אחת המייצגת כל אחד מהערוצים בתמונה המקורית צריכה להיות נוכחת. פתח את CellProfiler ולאחר מכן לחץ על מודול קלט התמונות וגרור את תיקיית מודול CellProfiler לתוך החלון שאומר שחרר קבצים ותיקיות כאן. אם רשימת תמונות קיימת מניתוח קודם, הסר אותן תחילה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון ובחירה באפשרות נקה רשימת קבצים.
לחץ על מודול קלט מטה-נתונים ועל שיטת החילוץ השנייה, לחץ על התיקייה הצהובה ונווט אל תיקיית המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט יישור תולעת. בחר את קובץ ההגדרות ולאחר מכן לחץ על עדכן. לאחר מכן, לחץ על השמות והסוגים של מודול הקלט וודא שכל התמונות הדרושות עבור הצבר קיימות.
לפני הפעלת הצבר, בחר יעד עבור תוצאות הפלט במודול הפלט. השתמש במצב הבדיקה כדי לראות את הביצועים של הצבר על-ידי לחיצה על הפעל מצב בדיקה ואפשר לו לעבור על התמונה הראשונה בתיקיה. כאשר אתה מרוצה מביצועי הצבר, לחץ על צא ממצב בדיקה ונתח תמונות.
לפני תחילת הניתוח, ודא שכל העיניים מול מודול הניתוח סגורות. לאחר השלמת הניתוח, פתח את תיקיית Worm_CP המורכבת משני קבצי CSV, תולעים CSV וקווים CSV. Culturing והדמיה C.elegans על פי השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת תמונות סקירה גדולות של אוכלוסיות תולעים.
הפלט של הצינור תלוי במידה רבה באיכות הקווים שצוירו על גבי התמונות. מספר דוגמאות שורה והפלט שלהן מישור תולעת מוצגים כאן. בעת שימוש בתסריט יישור תולעת, זיהוי חזותי של תולעים מצטלבים אפשרי מתמונות שכבת-על שנמצאו בתת-תיקיית הנתונים, כמו גם מהלוחות של תולעים בודדות במונטאז'.
ניתן להשתמש בטבלת QC גם לזיהוי תולעים חופפות. עם זאת, קווים מצטלבים הם בעייתיים עבור Worm_CP הצינור. הסיבה לכך היא Worm_CP משתמש במסכת קו, לא באזורים מעניינים, כדי לסייע בזיהוי תולעים בודדות.
לכן, CellProfiler יקטע את אחת התולעים כשני אובייקטים. צינור Worm_CP שימש לכימות עוצמת פלואורסצנטיות מבעלי חיים קבועים המסומנים בצבע פלואורסצנטי המשלב טיפות שומנים. תוכן טיפת השומנים יורד ב-17% בין סוג הבר לבין בעלי חיים מוטנטים מסוג DBL1 באמצעות כימות ידני, וב-12% באמצעות Worm_CP הדם.
Worm_CP שימש גם לכימות תגובת הלם החום בתולעים חיות המבטאת GFP תחת שליטה של גן בלתי ניתן לריפוי הלם חום. בהיעדר עומס חום, התולעים לא גרמו לביטוי GFP. כאשר התולעים נחשפות כהלם חום קצר, ביטוי GFP הוא המושרה.
הפלט של Worm_CP תלוי במידה רבה באיכות הקווים שאתה מצייר באמצעות יישור תולעת. ודא שהקווים שלך אינם נוגעים או חופפים וצייר את כל הקווים באותו כיוון. בדיקת טבלת QC יכולה לסייע לך לזהות קווים נוגעים ללב או חופפים כדי שתוכל לא לכלול אירועים אלה בניתוח שלך.
ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכמות עוקב בפיג'י או בחבילות תוכנה אחרות לניתוח תמונות. הראינו כאן צינור CellProfiler בסיסי מאוד שלתוכו מודולי ניתוח אחרים יכולים בקלות רבה להיות משולבים, למשל, כדי לספור את מספר טיפות השומנים או לכמת את עוצמת טיפות בודדות בתוך תולעת. אחד היתרונות של טכניקה זו היא אפשרות לכמת פלואורסצנטיות מתולעים בודדות במהירות.
במעבדה שלנו, יש לנו עניין בכדאיות אישית באמצעות כתבי פלואורסצנטיות ואנחנו משתמשים בתולעת ליישר Worm_CP באופן שגרתי למטרה זו.
