אנו מודים לקוסוקה יוסה על שיתוף הפלסמידים pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK ו- pCMV-hyPBase. אנו מודים לג'יה-יין יאנג ולקרמג'יט סינג-דולט על דיונים מועילים בנושא עריכת גנום. מעבדת D.C.H. נתמכת על ידי פרס ממשרד המדען הראשי (TC/16/37) ופלטפורמת הרפואה הרגנרטיבית בבריטניה (MR/L022974/1). Y.W. נתמך על ידי מלגת דוקטורט במימון מועצת המלגות הסינית ואוניברסיטת אדינבורו.

1. תכנון ובניית פלסמידי ביטוי CRISPR/Cas9n-sgRNA
<ol><li>חפש רצפי מדריך של 20 bp ישירות במעלה הזרם של כל 5'-NGG ליד האתר לשינוי. יש צורך בזוג רנ"א חד-מנחה (sgRNAs) כאשר נעשה שימוש בניקאז Cas9 (Cas9n) מסטרפטוקוקוס פיוגנס . זוג ה-sgRNAs חייבים להיות מסוגלים לייצר 5' overhangs עם ניקינג עם היסט של -4 עד 20 bp6.</li>
	<li>סדר אוליגוס הכרחי ו pSpCas9n-2A-puro וקטור.</li>
	<li>שכפל sgRNA לתוך וקטור pSpCas9n לביטוי משותף עם Cas9n בעקבות פרוטוקולשפורסם 12.</li>
</ol>2. תכנון ובניית וקטור מיקוד מבוסס piggyBac
<ol><li>הורד את רצף גני היעד וחפש אתר TTAA ליד האתר לשינוי. הערה: המרחק בין אתר TTAA לבין האתר המיועד לשינוי צריך להיות קטן ככל האפשר. אם בתוך רצף קידוד ואין אתר TTAA קיים במרחק של 100 bp, יש צורך להציג אחד על ידי ביצוע תחליפי נוקלאוטידים נרדפים.</li>
	<li>תכננו זרועות הומולוגיות (HAs) ושלבו מוטציות נקודתיות רצויות ב-HAs. האורך האופטימלי של HAs צריך להיות סביב 500 - 1200 bp. הערה: מומלץ להכניס תחליפי נוקלאוטידים נרדפים כדי לבצע מוטציה ברצף PAM על מנת למנוע ביקוע מחדש פוטנציאלי של Cas9n.</li>
	<li>בנה את וקטור המיקוד הסופי בהתאם לפרוטוקול10 שנקבע. הערה: בווקטור המיקוד המשמש כאן, קלטת בחירה של מקדם PGK המונעת על ידי puro-deltaTK מוקפת בחזרות הפוכות טרנספוזון.</li>
</ol>3. עריכה גנטית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
<ol><li>שמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על משטחים רקומביננטיים מצופים למינין 521 (5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-mTeSR1 בינוני13. התאים אמורים להגיע למפגש של 70-85% לאחר 72 שעות לאחר יחס פיצול של 1:3. הערה: אם הם קיימים, הסר תאים שהתמייננו באופן ספונטני לפני שינוי בינוני יומיומי על-ידי שאיפתם בעדינות.</li>
	<li>ביום ההעברה, צפו מספיק בארות של צלחת 24 בארות עם 300 μL של תמיסת laminin 521 (5 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפחות.</li>
	<li>הסר את תמיסת הציפוי בעדינות והוסף 300 μL של מדיום mTeSR1 טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 μM לכל באר, ולאחר מכן החזיר את הצלחת לאינקובטור כדי לקבל תאים. הערה: אין לאפשר לצלחות להתייבש בשום שלב בעת הסרת תמיסת ציפוי הלמינין.</li>
	<li>להעביר את hPSCs המניות מן האינקובטור, להסיר בינוני בילה, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת באמצעות 1 מ"ל של סטרילי 1x DPBS.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה עדינה של תאים לכל באר של צלחת 6 בארות ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6-8 דקות כדי לנתק את התאים. הערה: הקש בעדינות על הצלחת ובדוק אם התאים יכולים להתנתק בקלות כדי להחליט אם העיכול ארוך מספיק.</li>
	<li>פיפטה עדינה למעלה ולמטה באמצעות קצה P1000 כדי להרים את כל ה-hPSCs.</li>
	<li>סיים את הדיסוציאציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום mTeSR1 טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 μM (Y-27632) לתרחיף התא.</li>
	<li>מערבבים היטב ומעבירים את המתלה החד-תאי לצינור של 50 מ"ל, וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט, והחזיר את התאים היטב במדיום mTeSR1 טרי של 2 מ"ל בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.</li>
	<li>לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer. השתמש ב-Trypan Blue כדי להכתים ולהוציא תאים מתים.</li>
	<li>העבר 8 x 10 5 עד 1 x 106 תאים חיים לצינור1.5 מ"ל עבור כל תגובת נוקלאופקציה וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות. ואז בזהירות לשאוף את supernatant.</li>
	<li>ערבבו 3 מיקרוגרם של פלסמידי הביטוי Cas9n-sgRNA הזוגיים ו-5 מיקרוגרם של פלסמיד וקטורי מיקוד ב-100 μL של תמיסת נוקלאוקציה מעורבת / תוסף מתוך ערכת הנוקלאופקציה של תאי גזע אנושיים. השתמש בפלסמיד בקרת GFP מהערכה והכן גם תערובת פלסמיד לבקרת GFP. הערה: חשוב להכין מקסי של כל הפלסמידים כדי להפחית את זיהום האנדוטוקסין לפני הנוקלאופקציה. ריכוז הפלסמידים צריך להיות בערך 1 מיקרוגרם / μL.</li>
	<li>השתמש בתערובת הדנ"א (נפח ~ 111 μL) כדי להשעות את התאים המוכנים ולהעביר אותו לקובט אלקטרופורציה (המסופק עם ערכת הנוקלאופקציה), תוך הימנעות מבועות.</li>
	<li>אלקטרופולציה של התאים באמצעות מכשיר הגרעין על ידי בחירת התנאים האופטימליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. הערה: אם משתמשים בערכת הגרעין לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בפעם הראשונה, יש צורך לבדוק את תוכנית האלקטרופורציה ולבחור את היעילה ביותר.</li>
	<li>יש להוסיף מיד 500 μL של צבע טרי וחם ל-37°C mTeSR1 בינוני בתוספת מעכב ROCK של 10 μM לתאים האלקטרופורטיביים. מעבירים את התערובת ל-2 בארות של צלחת בת 24 בארות שהוכנה משלבים 3.2 ו-3.3.</li>
	<li>החזירו במהירות את הצלחת לאינקובטור 37 °C / 5% CO2 ואפשרו לתאים להתאושש.</li>
	<li>12-16 שעות מאוחר יותר, שנה את אמצעי תחזוקת התא. אם התאים יצרו קשר בין התא, משכו את מעכב ה-ROCK, אם לא, המשיכו להשלים את התווך עם המעכב.</li>
	<li>בין 24-48 שעות, בדוק את יעילות הגרעין על ידי בחינת ביטוי GFP בתאי הביקורת. תאים חיוביים GFP צריך להיות לפחות 30 אחוזים.</li>
	<li>48 שעות לאחר הנוקלאופקציה, התחל לבחור תאים על ידי השלמת מדיום mTeSR1 עם 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin.</li>
	<li>72 שעות לאחר נטילת נוקלאופקציה, יש להשלים את המדיום mTeSR1 עם 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין. אם מפגש התאים נמוך מ -30%, גם להשלים את המדיום עם מעכב 10 μM ROCK.</li>
	<li>4-6 ימים לאחר הנוקלאופקציה, מעבירים את התאים העמידים לפורומיצין לצלחות של 10-15 x 96-באר בריכוז של 0.8 תאים/באר. הערה: חיוני להשלים את המדיום עם מעכב ROCK של 10 μM ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.</li>
	<li>שמור על תאים אלה בטמפרטורה של 37 °C / 10% CO2 למשך 10-12 ימים כדי ליצור מושבות שמקורן בתאים בודדים. יש לטעון את המדיום פעם אחת 7 ימים לאחר הזריעה. הערה: רמת CO2 מוגברת מסייעת ל-hPSCs בודדים ליצור מושבות מניסיוננו.</li>
	<li>מסמנים בארות המכילות מושבה אחת ומחליפים את המדיום במדיום mTeSR1 טרי המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין אך ללא מעכב ROCK. הערה: מנקודה זו ואילך, התאים יגדלו מתחת ל-37 °C/5% CO2.</li>
	<li>יומיים לאחר מכן, החליפו מדיום לבארות המכילות מושבות לא מובחנות. תוסף למדיום עם מעכב ROCK של 10 μM ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין. הערה: בבארות מסוימות, ייתכן שהתאים התמינו ויש להשליך אותם.</li>
	<li>השתמש בקצות פיפטה P2 כדי לגרד את המושבות בעדינות. מעבירים את תרחיף התאים שמקורו במושבה אחת ל-2 בארות חדשות על לוחות נפרדים של 96 בארות, ומשתמשים באחת לגנוטיפ ואחת לתחזוקה. הערה: חשוב לשמור בקפידה על המושבות ולשמור על רמת ההבחנה הספונטנית למינימום.</li>
	<li>הוציאו את הצלחת המכילה תאים לגנוטיפ ברגע שהמפגש ברוב הבארות הגיע ל-50% ומעלה. לזרוק את המדיום בילה ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS.</li>
	<li>Lyse התאים היטב באמצעות Bradley lysis buffer ולבודד דנ"א גנומי מכל באר בצלחת בעקבות פרוטוקול נלווה (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>השתמש בשיטת PCR של צומת שלושה פריימרים כדי לבצע גנוטיפ של זרועות הומולוגיה שמאליות וימניות באופן עצמאי10. הערה: סכימה המציגה את שיטת ה-PCR מוצגת באיור 2.</li>
	<li>שלח את מוצרי ה- PCR של הצומת עבור שתי זרועות הומולוגיה מ 4-5 מושבות לריצוף סנגר וקבל את הרצפים. הערה: תוצאת הריצוף של 2 מושבות מבוססות מוצגת באיור 3A.</li>
	<li>שמור על מושבות עם הגנוטיפ הנכון והשלך את השאר.</li>
	<li>הרחיבו את המושבות הנכונות תחת בחירת פורומיצין רציפה והקפיאו אותן במעבר המוקדם ביותר האפשרי.</li>
</ol>4. הסרת טרנספוזון מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ממוקדים
<ol><li>שמור על מושבה אחת עם גנוטיפ נכון תחת 0.5 מיקרוגרם / מ"ל בחירת פורומיצין.</li>
	<li>Nucleofect 8 x 10 5 עד 1 x 106 תאים עם5 מיקרוגרם טרנספוזאז היפראקטיבי (pCMV-hyPBase) כמתואר לעיל (סעיף 3, שלבים 3.4-3.18). בצע גרעין בקרת GFP במקביל. הערה: יש להסיר את פורומיצין מהמדיום mTeSR1 מיד לאחר יצירת הגרעין של תאים אלה.</li>
	<li>לגדול ולסנן תאים עם קלטת הבחירה puro-deltaTK הוסרה בעקבות נהלים שפורסמו10. הערה: חשוב לעקוב בקפידה אחר ההליכים המקוריים. FIAU, או 1-(2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-יודוראציל), שימש כאנלוגיה של תימידין עבור הרפס סימפלקס מבוסס וירוס תימידין קינאז (HSV-tk).</li>
	<li>רצף את האזור שהשתנה כדי לאשר את הסרת הטרנספוזון. הערה: תוצאת הרצף של 3 מושבות מבוססות מוצגת באיור 3B.</li>
	<li>שמור על מושבות עם הגנוטיפ הנכון והתרחב לשימוש נוסף.</li>
	<li>לבצע אפיון של סמני פלוריפוטנטיות במושבות הנבחרות לפני השימוש בהם לניתוח נוסף. הערה: האפיון של שתי מושבות מבוססות מוצג באיור 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H הוא מייסד שותף, בעל מניות ודירקטור של Stemnovate Limited.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש להחדרת מוטציות נקודתיות קבועות מראש לתוך מוקד אנדוגני ב- hPSCs. השילוב של וקטור מיקוד מבוסס piggyBac ופלסמידי ביטוי CRISPR/Cas9n מזווגים הוכיח את עצמו כאמין ויעיל11. לאחר עריכת גנים של HNF4α, 12 מתוך 43 שיבוטים שנותחו היו ממוקדים בצורה נכונה כפי שנקבע על ידי בדיקת PCR בצומת. באופן ספציפי, יעילות המיקוד הדו-אלילי הייתה כ-21% (9/43) ויעילות המיקוד המונואלילית הייתה סביב 7% (3/43).
בעקבות ניסויי מיקוד, חיוני לשמור על בחירת פורומיצין כדי לשמור על הלוקוס הממוקד נגיש לטרנספוזאז piggyBac במהלך הסיבוב הראשון של ההקרנה. זה ימזער את ההשתקה של קלטת הבחירה Puro-deltaTK המונעת על ידי מקדם PGK ויפחית את הרקע בסיבוב השני של ההקרנה10. דו"ח שפורסם לאחרונה הראה כי מקדם CAG עמיד יותר להשתקה מאשר מקדם PGK ב-hPSCs14. שינוי המקדם לקלטת הבחירה יכול אפוא לשפר מערכת זו בעתיד. כמו כן, חשוב להשוות את מספר המושבות העמידות של תאים שעברו טרנספקציה של HyPBase ו-GFP. לאחר הסרה מוצלחת של הטרנספוזון, אמורות להיות יותר מושבות ששרדו מה-hyPBase- מאשר תאים שעברו טרנספקציה של GFP. בנוסף לניתוח PCR של כריתת טרנספוזון, נדרש רצף ישיר של האזור שהשתנה כדי לאשר את נאמנות הכריתה.
בהתבסס על אסטרטגיית וקטור המיקוד מבוססת ה-piggyBac של Yusa, 9,10, ההליכים המפורטים לעיל התמקדו בשיפור הנוקלאוקציה של hPSCs ויעילות השיבוט של תאים בודדים. צפיפות זריעת התאים עברה אופטימיזציה כדי להפחית את הסבירות להיווצרות מושבות הטרוגניות. השתמשנו גם בתרבית של 10-12 ימים תחת 10% CO2 כדי לשפר את ייצור המושבה לבדיקת גנוטיפ. מניסיוננו, ניתן היה להשיג כ-20 מושבות מכל צלחת 96 בארות. למרות שצעד זה עשוי להימשך זמן רב יותר משיטות אחרות, הוא אמין ויעיל ביותר.
בהתבסס על הצורך, וקטורים ממוקדים יכולים להיות מתוכננים כדי להציג או לתקן מוטציות נקודה, כדי ליצור קווי תאים מדווחים, כמו גם ביטוי גנים נוקאאוט. לסיכום, השילוב של מערכת CRISPR/Cas9(n) ווקטור מיקוד הוא דרך יעילה לספק סוגים שונים של hPSCs מהונדסים גנטית.

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מייצגים מקור בלתי מוגבל של תאים סומטיים למחקר או למרפאה1. מיקוד גנים ב-hPSCs מציע שיטה רבת עוצמה לחקור את תפקוד הגנים במהלך אפיון התא ולהבין מנגנונים של מחלות. למרות שקיימות שיטות יעילות לעריכת גנום, שינוי גנים ב-hPSCs נותר מאתגר מבחינה טכנית. מיקוד גנים סטנדרטי על ידי רקומבינציה הומולוגית ב-hPSCs מתרחש בתדירות נמוכה או אפילו אינו ניתן לגילוי בגנים מסוימים 2, ולכן יש צורך בשבירת גנים דו-גדיליים של דנ"א (DSB) (המכונה עריכת גנים) בתאים אלה 2,3. בנוסף, העברה של hPSCs ושיבוט חד-תאי לאחר מכן אינה יעילה במיוחד, אף על פי שניתן להפחית אפופטוזיס הקשור לתאים בודדים באמצעות שימוש במעכב החלבון קינאז (ROCK)4 הקשור ל-Rho. לבסוף, המוטציות הפוטנציאליות ממוקדות מטרה ומחוצה להן בגן המעניין יכולות גם הן להיות בעייתיות. לפיכך, פרוטוקול אמין הוא חיוני כדי לבצע שינויים גנטיים מותאמים ב- hPSCs.
טכנולוגיית הקריספר מונחית ה-RNA (אשכולות חוזרים פלינדרומיים קצרים בין-מרחביים באופן קבוע) וחלבון 9 הקשור לקריספר (Cas9) היא כיום כלי מבוסס היטב בעריכת גנים. רנ"א קריספר מתועתק (crRNA) ורנ"א מפעיל טרנס (tracrRNA) יוצרים את ה-RNA המנחה היחיד (sgRNA), אשר מורכב עם חלבון Cas9 המאפשר ביקוע ספציפי לגן5. מערכת CRISPR/Cas9 ניתנת לתכנות, על ידי שינוי רצף מדריך של 20 bp של ה-sgRNA, כלומר ניתן לערוך כמעט כל לוקוס הממלא את דרישת המוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר (PAM). עם זאת, ה-Cas9 מהסוג הפראי יכול לסבול כמה אי-התאמות בין רצף ההנחיה שלו לבין מטרת הדנ"א, מה שעלול לגרום להשפעות לא רצויות מחוץ למטרה. כדי לשפר את הספציפיות שלו, מוטציה ניקאז (Cas9n) פותחה. מוטציית Cas9n המכילה D10A או N863A היא בעלת תחום נוקלאז פונקציונלי אחד בלבד וכתוצאה מכך יכולה לנקר דנ"א רק על גדיל אחד. זוג Cas9n מרווח ומכוון כראוי יכול לגרום ביעילות ל- DNA DSB וההשפעות מחוץ למטרה מופחתות באופן דרמטי6. כדי להבטיח שינוי יעיל של Cas9n, הוכח כי שני Cas9n-sgRNA צריכים להיות ממוקמים באופן אידיאלי עם היסט של -4 עד 20 bp ותמיד ליצור תקרהשל 5' 6.
ניתן להשתמש ב-DSB המושרה על ידי Cas9(n)-sgRNA לעריכת גנוםב-hPSCs 7,8. הוא יכול ליצור נוקאאוט גנים באמצעות תיקון הצטרפות קצה לא הומולוגי, או להכניס שינוי גנים באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) אם קיימת תבנית DNA של תורם. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בפלסמיד תורם מבוסס טרנספוזון piggyBac (או וקטור מיקוד) עבור HDR, שבו סמן עמידות לתרופות מוקף בחזרות הפוכות טרנספוזון. היתרון של גישה זו כולל סינון יעיל ועריכת גנים חלקה כפי שהוכח לראשונה על ידי Yusa et al.9,10. קלטת בחירת התרופה מאפשרת העשרה של תאים עם וקטור משולב, אשר לאחר מכן נבדקים על ידי צומת PCR כדי לזהות את אלה שמקורם ב- HDR. בנוסף, ניתן למקם את קלטת בחירת התרופות כך שתחליף את רצפי המטרה עבור ביקוע Cas9(n), כך שלא תתרחש שבירת דנ"א נוספת לאחר HDR, ובכך תבטל מוטציות מטרה 'על' הנובעות ממחשוף מחדש של Cas9(n). יתר על כן, על ידי ניצול הכריתה המדויקת המזורזת על ידי טרנספוזאז piggyBac, סמן הבחירה נכרת מהגנום מבלי להשאיר צלקת. רק רצף ה- TTAA האנדוגני המקורי להחדרת piggyBac נשאר לאחר הסרת סמן בחירת התרופה9. גם אם יש ליצור את אתרי TTAA על ידי הצגת החלפות, הסיכויים לאלמנטים רגולטוריים מטרידים מצטמצמים בהשוואה לשיטות אחרות10.
כאן אנו מתארים נהלים מפורטים ליישום עריכת גנום חלקה ב- hPSCs. בשילוב של פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטציה של ניקאז CRISPR-Cas9 בברירה גנטית דו-שלבית, החדרנו שתי מוטציות נקודתיות קבועות מראש לגן ההפטוציטים הגרעיני פקטור 4 אלפא (HNF4α)11. גישה זו אמינה ויעילה, ואפשרה ניתוח מעמיק של התפקידים החשובים שממלא HNF4α במפרט אנדודרם והפטוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

אנדונוקלאזות שתוכננו בהתאמה אישית, כגון אשכולות מונחי RNA עם חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)-Cas9, מאפשרות עריכה יעילה של הגנום בתאי יונקים. כאן אנו מתארים הליכים מפורטים לעריכת גנום חלקה של הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) לוקוס כדוגמה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. בשילוב של פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטציה של ניקאז CRISPR-Cas9 בברירה גנטית דו-שלבית, אנו מדגימים מיקוד נכון ויעיל של לוקוס HNF4α.

התמקדות באסטרטגיית דפיקה מבוססת וקטורים הגן ההפטוציטים הגרעיני פקטור 4 אלפא (HNF4α) נבחר לעריכת גנום ממוקדת כדי להכניס שתי מוטציות נקודתיות לאקסון 8. זוג Cas9n-sgRNA עם היסט של 11 bp תוכנן קרוב לאתר לשינוי. וקטור המיקוד מבוסס piggyBac עבד כתבנית תיקון מכוונת הומולוגיה להצגת מוטציות הנקודה הרצויות. 967 bp 5'-HA ו-1142 bp 3'-HA המשלבים תחליפי נוקלאוטידים נרדפים או מוטציות הנקודה הרצויה הוגברו ושוכפלו לווקטור המיקוד הסופי. אתר ההחדרה של piggyBac היה במרחק של 16 bp ו-22 bp משתי המוטציות הנקודתיות הרצויות. מושבות המכילות את קלטת הבחירה puro-deltaTK נבחרו עם פורומיצין בסיבוב הראשון. לאחר שקלטת הברירה הוסרה על-ידי כריתת טרנספוזאז בסיבוב השני, האתר הממוקד שונה בצורה חלקה כאשר רק מוטציות הנקודה הרצויות שולבו בגן (איור 1).
עריכה גנטית בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי לסנן תאים ממוקדים כהלכה, נעשה שימוש בשיטת PCR מבוססת פריימר לגנוטיפ (איור 2). ריצוף סנגר בוצע כדי לאשר את תוצאות ה-PCR (איור 3A). לאחר הסרת קלטת הבחירה, האזור שהשתנה רוצף שוב כדי לאשר את ההקדמה הנכונה של מוטציות נקודה רצויות (איור 3B).
הקמת מושבה ואפיון תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ערוכים מושבות עם הגנוטיפ הנכון נבחרו והורחבו לפי הצורך. יש לאפיין את המושבות שהוקמו לפני שישמשו לניתוח נוסף. לתאים הערוכים יש אותה מורפולוגיה כמו לתאי ההורים (איור 4A). הם גם מבטאים סמנים מייצגים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, כולל גורמי שעתוק NANOG ו-OCT4 (איור 4 B), כמו גם סמני פני השטח של התא SSEA4 ו-TRA-1-60 (איור 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> איור 1: מיקוד אסטרטגיית דפיקה מבוססת וקטורים11. זוג פלסמידים לביטוי Cas9n-sgRNA שימשו כדי לגרום לשבירת דנ"א דו-גדילי באקסון 8 של הגן HNF4α. וקטור מיקוד עם קלטת סלקציה שימש להחדרת מוטציות נקודתיות קבועות מראש הממוקמות במרחק של 16 bp ו-22 bp. קלטת בחירה זו נכללה בתוך הטרנספוזון piggyBac , המורכב מסמן בחירה חיובי-שלילי (puro-deltaTK) המונע על ידי מקדם פעיל (PGK). באמצעות מסלול תיקון מכוון הומולוגיה, התאים הממוקדים שילבו את קלטת הבחירה. כריתת טרנספוזון בתיווך טרנספוז גורמת לשינוי חלק כאשר רק המוטציות הנקודתיות קיימות. הצלב האדום מציין את המיקום של מוטציות הנקודה הרצויה. HA = זרוע הומולוגיה; PB = חזיריבאק; PM = מוטציה נקודתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> איור 2: שלוש שיטות PCR מבוססות פריימר. כדי לסנן תאים ממוקדי גנים, נעשה שימוש בגנוטיפ מבוסס PCR. שלושה פריימרים, LA-F1, -R1 ו-R2 שימשו להגברת אזור זרוע ההומולוגיה השמאלית. באופן עצמאי, RA-F1, -F2 ו-R1 שימשו להגברת אזור זרוע ההומולוגיה הימנית. בהתבסס על תוצאת האלקטרופורזה בג'ל, תאים שאינם ממוקדים, ותאים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטיים, נבדלו זה מזה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> איור 3: תוצאות ריצוף של תאים מהונדסים גנטית11. תוצרי PCR משני שיבוטים רוצפו ואישרו את ההכנסה הנכונה של קלטת הבחירה בלוקוס הממוקד (A). 5' ו-3' piggyBac חזרות מסוף הפוכות (ITR) היו מוקפות על ידי החזרות הישירות של TTAA. שלושה שיבוטים היו רצף לאחר כריתת טרנספוזון (B). זוג Cas9n-sgRNA עם היסט של 11 bp שימש להחדרת שבר דו-גדילי של DNA. שתי מוטציות נקודתיות קבועות מראש (A עד G ו-A עד C) הוכנסו לגן. מוטציה נרדפת אחת הוכנסה כדי לשנות את מוטיב הפרוטו-ספייסר הסמוך (PAM), ומוטיב אחר כדי ליצור את אתר TTAA הנחוץ לכריתת piggyBac . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> איור 4: אפיון של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ערוכים. מורפולוגיה של שתי שורות תאים ערוכות ותאי האב (A), סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הביטוי של סמני תאי גזע פלוריפוטנטיים NANOG ו-OCT4 שנבדקו על ידי אימונוסטינינג (B, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר), בנוסף ל-SSEA4 ו-TRA-1-60 על ידי ציטומטריה של זרימה (C) בשני קווי תאים שעברו שינוי ובתאי ההורים. IgG שימש כבקרה שלילית. DAPI שימש כדי להכתים את הגרעין. האחוזים חושבו כממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

introducing-point-mutations-into-human-pluripotent-stem-cells-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

3.9K Views.  University of Edinburgh. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

Video: Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

בתיווך CRISPR הגנום עריכה של פטריות פתוגניות קנדידה אלביקנס

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...