Nous remercions Kosuke Yusa d’avoir partagé les plasmides pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK et pCMV-hyPBase. Nous remercions Jia-Yin Yang et Karamjit Singh-Dolt pour leurs discussions utiles sur l’édition du génome. Le laboratoire D.C.H. est soutenu par un prix du Chief Scientist Office (TC/16/37) et de la UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. a été soutenu par une bourse de doctorat financée par le Chinese Scholarship Council et l’Université d’Édimbourg.

1. Conception et construction de plasmides d’expression CRISPR/Cas9n-sgRNA
<ol><li>Recherchez des séquences guides de 20 pb directement en amont de n’importe quel 5'-NGG près du site à modifier. Une paire d’ARN monoguides (sgRNA) est nécessaire lorsque la nickase Cas9 (Cas9n) de Streptococcus pyogenes est utilisée. La paire d’ARNg doit être capable de générer des surplombs de 5' lors de l’entaille avec un décalage de -4 à 20 pb6.</li>
	<li>Ordre des oligos nécessaires et du vecteur pSpCas9n-2A-puro.</li>
	<li>Cloner l’ARNg dans le vecteur pSpCas9n pour une co-expression avec Cas9n en suivant le protocolepublié 12.</li>
</ol>2. Conception et construction d’un vecteur de ciblage basé sur piggyBac
<ol><li>Téléchargez la séquence du gène cible et recherchez un site TTAA près du site à modifier. REMARQUE : La distance entre le site TTAA et le site à modifier doit être aussi petite que possible. Si dans la séquence de codage et qu’aucun site TTAA n’est présent à moins de 100 pb, il est nécessaire d’en introduire un en faisant des substitutions nucléotidiques synonymes.</li>
	<li>Concevoir des bras d’homologie (HA) et incorporer les mutations ponctuelles souhaitées dans les HA. La longueur optimale des HA devrait être d’environ 500 - 1200 pb. REMARQUE: Il est recommandé d’introduire des substitutions nucléotidiques synonymes pour muter la séquence PAM afin d’éviter un éventuel reclivage Cas9n.</li>
	<li>Construire le vecteur de ciblage final en suivant un protocole établi10. REMARQUE : Dans le vecteur de ciblage utilisé ici, une cassette de sélection puro-deltaTK pilotée par un promoteur PGK est flanquée de répétitions inversées par transposon.</li>
</ol>3. Édition génétique de cellules souches pluripotentes humaines
<ol><li>Maintenir les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 sur des surfaces recouvertes de laminine 521 recombinante (5 μg/mL) dans un milieu mTeSR113. Les cellules devraient atteindre une confluence de 70 à 85 % après 72 heures suivant un rapport fractionné de 1:3. REMARQUE: Si présent, retirez spontanément les cellules différenciées avant le changement quotidien de milieu en les aspirant doucement.</li>
	<li>Le jour de la transfection, enduire suffisamment de puits d’une plaque de 24 puits avec 300 μL de la solution de laminine 521 (5 μg/mL) à 37 °C pendant au moins 2 h.</li>
	<li>Retirez délicatement la solution d’enrobage et ajoutez 300 μL de milieu mTeSR1 frais complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM à chaque puits, puis remettez la plaque dans l’incubateur pour recevoir les cellules. REMARQUE: Ne laissez pas les plaques sécher à tout moment lorsque la solution de revêtement de laminine est retirée.</li>
	<li>Déplacez les CSPh de base de l’incubateur, retirez le milieu usé, puis lavez les cellules une fois en utilisant 1 ml de 1x DPBS stérile.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire douce à chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber à 37 °C pendant 6-8 min pour dissocier les cellules. REMARQUE: Tapotez doucement la plaque et vérifiez si les cellules peuvent se détacher facilement pour décider si la digestion est assez longue.</li>
	<li>Pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’un embout P1000 pour soulever tous les CSPh.</li>
	<li>Mettre fin à la dissociation en ajoutant 2 mL de milieu mTeSR1 frais complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632) à la suspension cellulaire.</li>
	<li>Bien mélanger et transférer la suspension unicellulaire dans un tube de 50 mL et centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le surnageant et bien remettre les cellules en suspension dans un milieu mTeSR1 frais de 2 mL complété par un inhibiteur ROCK de 10 μM.</li>
	<li>Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. Utilisez Trypan Blue pour colorer et exclure les cellules mortes.</li>
	<li>Transvaser 8 x 10 5 à 1 x 106 cellules vivantes dans un tube de1,5 mL pour chaque réaction de nucléofection et centrifuger à 200 x g pendant 3 min. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant.</li>
	<li>Mélanger 3 μg de plasmides d’expression appariés Cas9n-sgRNA et 5 μg de plasmide vecteur cible dans 100 μL de solution / supplément de nucléofection mixte du kit de nucléofection de cellules souches humaines. Utilisez le plasmide de contrôle GFP du kit et préparez également un mélange de plasmides de contrôle GFP. NOTE: Il est important de faire une maxi-préparation de tous les plasmides pour réduire la contamination par les endotoxines avant la nucléofection. La concentration des plasmides doit être d’environ 1 μg/μL.</li>
	<li>Utilisez le mélange d’ADN (volume ~111 μL) pour remettre en suspension les cellules préparées et transférez-le dans une cuvette d’électroporation (fournie avec le kit de nucléofection), en évitant toute bulle.</li>
	<li>Électroporate les cellules à l’aide du dispositif de nucléofection en sélectionnant les conditions optimisées pour les cellules souches pluripotentes humaines. REMARQUE: Si vous utilisez le kit de nucléofection pour les cellules souches pluripotentes humaines pour la première fois, il est nécessaire de tester le programme d’électroporation et de choisir le plus efficace.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 500 μL de milieu mTeSR1 frais et chaud à 37 °C complété par un inhibiteur ROCK de 10 μM aux cellules électroporées. Transférer le mélange dans 2 puits d’une plaque de 24 puits préparée à partir des étapes 3.2 et 3.3.</li>
	<li>Remettez rapidement la plaque dans l’incubateur à 37 °C/5% de CO2 et laissez les cellules récupérer.</li>
	<li>12-16 h plus tard, changer le support d’entretien de la cellule. Si les cellules ont établi un contact cellule-cellule, retirer l’inhibiteur de ROCK, sinon, continuer à compléter le milieu avec l’inhibiteur.</li>
	<li>Entre 24 et 48 h, vérifier l’efficacité de la nucléofection en examinant l’expression de la GFP dans les cellules témoins. Les cellules GFP positives devraient être d’au moins 30%.</li>
	<li>48 h après la nucléofection, commencer à sélectionner les cellules en complétant le milieu mTeSR1 avec 1 μg/mL de puromycine.</li>
	<li>72 h après nucléofection, compléter le milieu mTeSR1 avec 0,5 μg/mL de puromycine. Si la confluence cellulaire est inférieure à 30%, complétez également le milieu avec un inhibiteur ROCK de 10 μM.</li>
	<li>4-6 jours après la nucléofection, faire passer les cellules résistantes à la puromycine dans des plaques de 10-15 x 96 puits à la concentration de 0,8 cellule/puits. NOTE: Il est essentiel de compléter le milieu avec un inhibiteur de ROCK de 10 μM et 0,5 μg / mL de puromycine.</li>
	<li>Maintenir ces cellules à 37 °C/10 % de CO2 pendant 10 à 12 jours pour former des colonies dérivées de cellules uniques. Compléter le milieu une fois 7 jours après le semis. REMARQUE: L’augmentation du niveau de CO2 aide les CSPh simples à former des colonies d’après notre expérience.</li>
	<li>Marquer les puits contenant une seule colonie et remplacer le milieu par un milieu mTeSR1 frais contenant 0,5 μg/mL de puromycine, mais aucun inhibiteur de ROCK. NOTE: À partir de ce moment, les cellules seront cultivées sous 37 ° C / 5% CO2.</li>
	<li>Deux jours plus tard, changer de milieu pour les puits contenant des colonies indifférenciées. Compléter le milieu avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK et 0,5 μg/mL de puromycine. REMARQUE: Dans certains puits, les cellules peuvent s’être différenciées et doivent être jetées.</li>
	<li>Utilisez les pointes de pipette P2 pour gratter doucement les colonies. Transférer la suspension cellulaire dérivée d’une colonie dans 2 nouveaux puits sur des plaques séparées de 96 puits, et en utiliser une pour le génotypage et une pour l’entretien. NOTE: Il est important de maintenir soigneusement les colonies et de maintenir le niveau de différenciation spontanée au minimum.</li>
	<li>Prélever la plaque contenant des cellules pour le génotypage une fois que la confluence dans la plupart des puits a atteint 50% ou plus. Videz le milieu usé, puis lavez les cellules une fois avec DPBS.</li>
	<li>Lyser les cellules dans le puits en utilisant le tampon de lyse Bradley et isoler l’ADN génomique de chaque puits dans la plaque en suivant le protocole associé (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Utiliser une méthode de PCR à jonction à trois amorces pour génotyper indépendamment les bras d’homologie gauche et droite10. REMARQUE : Un schéma illustrant la méthode PCR est présenté à la figure 2.</li>
	<li>Envoyez les produits PCR de jonction pour les deux bras d’homologie de 4-5 colonies pour le séquençage de Sanger et obtenez les séquences. REMARQUE : Le résultat du séquençage de 2 colonies établies est illustré à la figure 3A.</li>
	<li>Conservez les colonies avec le génotype correct et jetez le reste.</li>
	<li>Développez les colonies correctes sous sélection continue de puromycine et congelez-les le plus tôt possible.</li>
</ol>4. Élimination des transposons des cellules souches pluripotentes humaines ciblées
<ol><li>Maintenir une colonie avec le génotype correct sous la sélection de puromycine de 0,5 μg/mL.</li>
	<li>Nucléofect 8 x 10 5 à 1 x 106 cellules avec5 μg de transposase hyperactive (pCMV-hyPBase) comme décrit ci-dessus (Section 3, étapes 3.4-3.18). Effectuer une nucléofection de contrôle GFP en parallèle. REMARQUE: La puromycine doit être retirée du milieu mTeSR1 immédiatement après la nucléofectation de ces cellules.</li>
	<li>Cultiver et cribler les cellules en retirant la cassette de sélection puro-deltaTK conformément aux procédures publiées10. REMARQUE: Il est important de suivre attentivement les procédures originales. FIAU, ou 1-(2-désoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-iodouracil), a été utilisé comme analogue de la thymidine pour la sélection négative basée sur la thymidine kinase dérivée du virus de l’herpès simplex (HSV-tk).</li>
	<li>Séquencer la région modifiée pour confirmer le retrait du transposon. REMARQUE : Le résultat du séquençage de 3 colonies établies est illustré à la figure 3B.</li>
	<li>Conservez les colonies avec le génotype correct et développez-les pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Effectuer la caractérisation des marqueurs de pluripotence dans les colonies choisies avant de les utiliser pour une analyse plus approfondie. REMARQUE : La caractérisation de deux colonies établies est illustrée à la figure 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H est cofondateur, actionnaire et administrateur de Stemnovate Limited.

Le protocole décrit ici peut être utilisé pour introduire des mutations ponctuelles prédéterminées dans un locus endogène dans les CSPh. La combinaison d’un vecteur de ciblage basé sur piggyBac et de plasmides d’expression appariés CRISPR/Cas9n s’est avérée fiable et efficace11. Après l’édition du gène HNF4α, 12 des 43 clones analysés ont été correctement ciblés, comme déterminé par le criblage par PCR par jonction. Plus précisément, l’efficacité du ciblage biallélique était d’environ 21% (9/43) et l’efficacité du ciblage monoallélique était d’environ 7% (3/43).
Après les expériences de ciblage, il est crucial de maintenir la sélection de la puromycine pour garder le locus ciblé accessible à la transsaxe piggyBac lors du premier cycle de dépistage. Cela réduira au minimum le silence de la cassette de sélection puro-deltaTK pilotée par le promoteur PGK et réduira le bruit de fond lors de la deuxième ronde de sélection10. Un rapport récent a montré que le promoteur CAG est plus résistant au silençage que le promoteur PGK dans lesCSPh 14. Le changement de promoteur pour la cassette de sélection pourrait donc améliorer ce système à l’avenir. Il est également important de comparer le nombre de colonies résistantes de cellules transfectées par hyPBase et GFP. Après le retrait réussi du transposon, il devrait y avoir plus de colonies survivantes des cellules transfectées par la hyPBase que par GFP. En plus de l’analyse PCR de l’excision par transposons, le séquençage direct de la région modifiée est nécessaire pour confirmer la fidélité de l’excision.
Basées sur la stratégie de vecteurs de ciblage 9,10 basée sur le transposon piggyBac de Yusa, les procédures détaillées ci-dessus se sont concentrées sur l’amélioration de la nucléofection des CSPh et de l’efficacité du clonage de cellules uniques. La densité d’ensemencement cellulaire a été optimisée pour réduire la probabilité de formation de colonies hétérogènes. Nous avons également utilisé une culture de 10 à 12 jours contenant moins de 10 % de CO2 pour améliorer la production des colonies pour le dépistage du génotype. D’après notre expérience, environ 20 colonies ont pu être obtenues à partir de chaque plaque de 96 puits. Bien que cette étape puisse prendre plus de temps que d’autres méthodes, elle est fiable et très efficace.
En fonction des besoins, les vecteurs de ciblage peuvent être conçus pour introduire ou corriger des mutations ponctuelles, pour créer des lignées cellulaires rapporteures, ainsi que pour l’expression génique knockout. En conclusion, la combinaison du système CRISPR/Cas9(n) et d’un vecteur de ciblage est un moyen efficace de délivrer différents types de CSPh génétiquement modifiées.

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) représentent une source illimitée de cellules somatiques pour la recherche ou la clinique1. Le ciblage génique dans les CSPh offre une méthode puissante pour étudier la fonction des gènes lors de la spécification cellulaire et pour comprendre les mécanismes de la maladie. Bien qu’il existe des méthodes efficaces d’édition du génome, la modification des gènes dans les CSPh reste techniquement difficile. Le ciblage génique standard par recombinaison homologue dans les CSPh se produit à basse fréquence voire est indétectable au niveau de certains gènes 2, et le ciblage génique stimulé par la cassure double brin de l’ADN (DSB) (appelé édition génique) est donc nécessaire dans ces cellules 2,3. De plus, la transfection des CSPh et le clonage ultérieur d’une seule cellule ne sont pas très efficaces, même si l’apoptose associée à une seule cellule peut être réduite grâce à l’utilisation de l’inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK)4. Enfin, les mutations potentielles sur cible et hors cible au gène d’intérêt peuvent également être problématiques. Par conséquent, un protocole fiable est essentiel pour apporter des changements génétiques adaptés aux CSPh.
La technologie CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) guidée par ARN et la protéine 9 associée à CRISPR (Cas9) est maintenant un outil bien établi dans l’édition de gènes. L’ARN CRISPR transcrit (ARNcr) et un ARN trans-activateur (ARNtracr) forment l’ARN guide unique (ARNsg), qui se complexe avec la protéine Cas9 permettant un clivage spécifiquedu gène 5. Le système CRISPR / Cas9 est programmable, en changeant une séquence guide de 20 pb de l’ARNg, ce qui signifie que presque tous les locus qui remplissent l’exigence de motif adjacent protospacer (PAM) peuvent être modifiés. Cependant, le type sauvage Cas9 peut tolérer certaines incompatibilités entre sa séquence guide et une cible ADN, ce qui pourrait provoquer des effets indésirables hors cible. Pour améliorer sa spécificité, un mutant nickase (Cas9n) a été développé. Un Cas9n contenant une mutation D10A ou N863A ne possède qu’un seul domaine nucléase fonctionnel et, par conséquent, ne peut entailler l’ADN que sur un seul brin. Une paire de Cas9n correctement espacée et orientée peut induire efficacement l’ADN DSB et les effets hors cible sont considérablement réduits6. Pour assurer une modification efficace de Cas9n, il a été démontré que deux Cas9n-sgRNA devraient idéalement être placés avec un décalage de -4 à 20 pb et toujours créer un surplomb de 5'6.
Le DSB induit par Cas9(n)-sgRNA peut être utilisé pour l’édition du génome dans les CSPh 7,8. Il peut créer un knockout de gène via une réparation non homologue de jointure d’extrémité, ou introduire une modification génétique par réparation dirigée par homologie (HDR) si un modèle d’ADN de donneur est présent. Le protocole décrit ici utilise un plasmide donneur (ou vecteur de ciblage) basé sur le transposon piggyBac pour HDR, dans lequel un marqueur de résistance aux médicaments est flanqué des répétitions inversées du transposon. L’avantage de cette approche comprend un criblage efficace et une édition transparente des gènes, comme l’ont démontré pour la première fois Yusa et al.9,10. La cassette de sélection de médicaments permet d’enrichir les cellules avec le vecteur intégré, qui sont ensuite criblées par PCR à jonction pour identifier celles dérivées par HDR. En outre, la cassette de sélection de médicaments peut être positionnée pour remplacer les séquences cibles pour le clivage Cas9 (n), de sorte qu’aucune autre rupture de l’ADN ne se produit après HDR, éliminant ainsi les mutations « sur » de la cible résultant du reclivage de Cas9 (n). De plus, en exploitant l’excision précise catalysée par la transposase piggyBac, le marqueur de sélection est ensuite excisé du génome sans laisser de cicatrice. Seule la séquence endogène originale de TTAA pour l’insertion de piggyBac reste après le retrait du marqueur de sélection du médicament9. Même si les sites TTAA doivent être créés en introduisant des substitutions, les risques de perturber les éléments réglementaires sont réduits par rapport à d’autres méthodes10.
Nous décrivons ici des procédures détaillées pour la mise en œuvre de l’édition transparente du génome dans les CSPh. En combinant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant nickase CRISPR-Cas9 dans une sélection génétique en deux étapes, nous avons introduit deux mutations ponctuelles prédéterminées dans le gène11 du facteur nucléaire 4 alpha (HNF4α) des hépatocytes. Cette approche est fiable et efficace, et a permis des analyses approfondies des rôles importants joués par HNF4α dans la spécification de l’endoderme et des hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Les endonucléases conçues sur mesure, telles que CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 guidées par ARN, permettent une édition efficace du génome dans les cellules de mammifères. Nous décrivons ici des procédures détaillées pour modifier de manière transparente le locus du facteur nucléaire 4 alpha (HNF4α) des hépatocytes à titre d’exemple dans les cellules souches pluripotentes humaines. En combinant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant nickase CRISPR-Cas9 dans une sélection génétique en deux étapes, nous démontrons un ciblage correct et efficace du locus HNF4α.

Cibler la stratégie knock-in basée sur les vecteurs Le gène du facteur 4 alpha nucléaire des hépatocytes (HNF4α) a été choisi pour l’édition ciblée du génome afin d’introduire deux mutations ponctuelles dans l’exon 8. Une paire de Cas9n-sgRNA avec un décalage de 11 pb a été conçue à proximité du site à modifier. Le vecteur de ciblage basé sur piggyBac a fonctionné comme modèle de réparation dirigé par homologie pour introduire les mutations ponctuelles souhaitées. Un 5'-HA de 967 bp et un 3'-HA de 1142 bp incorporant des substitutions nucléotidiques synonymes ou les mutations ponctuelles souhaitées ont été amplifiés et clonés dans le vecteur de ciblage final. Le site d’insertion de piggyBac était à 16 pb et 22 pb des deux mutations ponctuelles souhaitées. Les colonies contenant la cassette de sélection puro-deltaTK ont été sélectionnées avec de la puromycine au premier tour. Une fois que la cassette de sélection a été retirée par excision de la transposase au deuxième tour, le site ciblé a été modifié de manière transparente avec seulement les mutations ponctuelles souhaitées incorporées dans le gène (Figure 1).
Édition génétique dans les cellules souches pluripotentes humaines Pour dépister les cellules correctement ciblées, une méthode de PCR à trois amorces a été utilisée pour le génotypage (Figure 2). Le séquençage de Sanger a été effectué pour confirmer les résultats de la PCR (Figure 3A). Après le retrait de la cassette de sélection, la région modifiée a été séquencée à nouveau pour confirmer l’introduction correcte des mutations ponctuelles souhaitées (Figure 3B).
Établissement de colonies et caractérisation de cellules souches pluripotentes humaines éditées Les colonies ayant le génotype correct ont été sélectionnées et élargies au besoin. Les colonies établies doivent être caractérisées avant d’être utilisées pour une analyse plus approfondie. Les cellules éditées possèdent la même morphologie que les cellules parentales (Figure 4A). Ils expriment également des marqueurs de cellules souches pluripotentes humaines représentatifs, y compris les facteurs de transcription NANOG et OCT4 (Figure 4 B), ainsi que les marqueurs de surface cellulaire SSEA4 et TRA-1-60 (Figure 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figure 1 : Stratégie de ciblage par coroll-invectorielle 11. Une paire de plasmides d’expression Cas9n-sgRNA a été utilisée pour induire une rupture double brin de l’ADN dans l’exon 8 du gène HNF4α. Un vecteur de ciblage avec une cassette de sélection a été utilisé pour introduire des mutations ponctuelles prédéterminées situées à 16 pb et 22 pb de distance. Cette cassette de sélection était contenue dans le transposon piggyBac , constitué d’un marqueur de sélection positif-négatif (puro-deltaTK) piloté par un promoteur constituant actif (PGK). Via une voie de réparation dirigée par homologie, les cellules ciblées ont incorporé la cassette de sélection. L’excision par transposon médiée par la transposase entraîne une modification transparente avec seulement les mutations ponctuelles présentes. La croix rouge indique l’emplacement des mutations ponctuelles souhaitées. HA = bras d’homologie; PB = piggyBac; PM = mutation ponctuelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figure 2 : Méthode de PCR à trois amorces. Pour cribler les cellules ciblant les gènes, le génotypage basé sur la PCR a été utilisé. Trois amorces, LA-F1, -R1 et -R2 ont été utilisées pour amplifier la région du bras d’homologie gauche. Indépendamment, RA-F1, -F2 et -R1 ont été utilisés pour amplifier la région du bras d’homologie droite. Sur la base du résultat de l’électrophorèse sur gel, les cellules non ciblées et les cellules hétérozygotes et homozygotes ont été distinguées les unes des autres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figure 3: Résultats du séquençage des cellules génétiquement modifiées11. Les produits PCR de deux clones ont été séquencés et ont confirmé l’insertion correcte de la cassette de sélection au locus ciblé (A). Les répétitions terminales inversées (ITR) de 5' et 3' piggyBac étaient flanquées des répétitions directes TTAA. Trois clones ont été séquencés après l’excision du transposon (B). Une paire d’ARNg Cas9n avec un décalage de 11 pb a été utilisée pour introduire la rupture double brin de l’ADN. Deux mutations ponctuelles prédéterminées (A à G et A à C) ont été introduites dans le gène. Une mutation synonyme a été introduite pour muter le motif adjacent au protospacer (PAM), et une autre pour créer le site TTAA nécessaire à l’excision de piggyBac . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figure 4 : Caractérisation de cellules souches pluripotentes humaines éditées. Morphologie de deux lignées cellulaires éditées et des cellules parentales (A), barre d’échelle = 100 μm. L’expression des marqueurs de cellules souches pluripotentes NANOG et OCT4 a été examinée par immunomarquage (B, barre d’échelle = 50 μm), en plus de SSEA4 et TRA-1-60 par cytométrie de flux (C) dans deux lignées cellulaires modifiées et les cellules parentales. Les IgG ont été utilisés comme contrôle négatif. DAPI a été utilisé pour colorer le noyau. Les pourcentages ont été calculés comme la moyenne de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

3.9K vues.  University of Edinburgh. Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Vidéo: Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Recherche

Génétique

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR-mediated génome édition du champignon pathogène humain Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Modification du génome dans des lignées de cellules mammifères à l’aide de CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...