Kosuke Yusa'ya pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK ve pCMV-hyPBase plazmidlerini paylaştığı için teşekkür ederiz. Jia-Yin Yang ve Karamjit Singh-Dolt'a genom düzenleme konusundaki yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. D.C.H. laboratuvarı, Baş Bilim İnsanı Ofisi (TC/16/37) ve İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu (MR/L022974/1) tarafından verilen bir ödülle desteklenmektedir. YW, Çin Burs Konseyi ve Edinburgh Üniversitesi tarafından finanse edilen bir doktora bursu ile desteklendi.

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA ekspresyon plazmidlerinin tasarlanması ve oluşturulması
<ol><li>Değiştirilecek sitenin yakınındaki herhangi bir 5'-NGG'nin doğrudan yukarı akışındaki 20-bp kılavuz dizilerini arayın. Streptococcus pyogenes'ten Cas9 nickaz (Cas9n) kullanıldığında bir çift tek kılavuzlu RNA'ya (sgRNA) ihtiyaç vardır. SgRNA çifti, -4 ila 20 bp ofset6 ile çentikleme üzerine 5' çıkıntı üretebilmelidir.</li>
	<li>Gerekli oligoları ve pSpCas9n-2A-puro vektörünü sipariş edin.</li>
	<li>Yayınlanan protokol12'yi takiben Cas9n ile birlikte ekspresyon için sgRNA'yı pSpCas9n vektörüne klonlayın.</li>
</ol>2. piggyBac tabanlı bir hedefleme vektörü tasarlamak ve oluşturmak
<ol><li>Hedef gen dizisini indirin ve değiştirilecek sitenin yakınındaki bir TTAA sitesini arayın. NOT: TTAA sitesi ile değiştirilecek site arasındaki mesafe mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Kodlama dizisi içinde ve 100-bp mesafede TTAA bölgesi yoksa, eş anlamlı nükleotid ikameleri yaparak bir tane tanıtmak gerekir.</li>
	<li>Homoloji kollarını (HA'lar) tasarlayın ve HA'larda istenen nokta mutasyonlarını dahil edin. HA'ların optimal uzunluğu 500 - 1200 bp civarında olmalıdır. NOT: Potansiyel Cas9n yeniden bölünmesini önlemek için PAM dizisini mutasyona uğratmak için eş anlamlı nükleotid ikamelerinin uygulanması önerilir.</li>
	<li>Belirlenmiş bir protokol10'u izleyerek nihai hedefleme vektörünü oluşturun. NOT: Burada kullanılan hedefleme vektöründe, PGK promotör tahrikli puro-deltaTK seçim kaseti transpozon ters tekrarlarla çevrilidir.</li>
</ol>3. İnsan pluripotent kök hücrelerinin genetik düzenlemesi
<ol><li>İnsan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve rekombinant laminin521 kaplı yüzeylerde (5 μg / mL) mTeSR1 ortam13'te %5 CO 2 tutun. Hücreler, 1: 3 bölünme oranını takiben 72 saat sonra% 70-85 akıcılığa ulaşmalıdır. NOT: Varsa, günlük ortam değişiminden önce kendiliğinden farklılaşmış hücreleri nazikçe aspire ederek çıkarın.</li>
	<li>Transfeksiyon gününde, 24 delikli bir plakanın yeterli kuyularını, 37 ° C'de 300 μL laminin 521 çözeltisi (5 μg / mL) ile en az 2 saat boyunca kaplayın.</li>
	<li>Kaplama çözeltisini nazikçe çıkarın ve her bir oyuğa 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 300 μL taze mTeSR1 ortamı ekleyin ve ardından hücreleri almak için plakayı inkübatöre geri koyun. NOT: Laminin kaplama çözeltisi çıkarıldığında plakaların herhangi bir noktada kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>Stok hPSC'leri inkübatörden hareket ettirin, harcanan ortamı çıkarın ve ardından 1 mL steril 1x DPBS kullanarak hücreleri bir kez yıkayın.</li>
	<li>6 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 6-8 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Plakaya hafifçe dokunun ve sindirimin yeterince uzun olup olmadığına karar vermek için hücrelerin kolayca ayrılıp ayrılamayacağını kontrol edin.</li>
	<li>Tüm hPSC'leri kaldırmak için bir P1000 ucu kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipet çekin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL taze mTeSR1 ortamı ekleyerek ayrışmayı sonlandırın.</li>
	<li>İyice karıştırın ve tek hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 2 mL taze mTeSR1 ortamında iyice askıya alın.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Ölü hücreleri boyamak ve dışlamak için Trypan Blue kullanın.</li>
	<li>Her nükleofeksiyon reaksiyonu için 8 x 10 5 ila 1 x 106 canlı hücreyi1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin.</li>
	<li>Eşleştirilmiş Cas9n-sgRNA ekspresyon plazmidlerinin 3 μg'ını ve 5 μg hedefleme vektörü plazmidini, insan kök hücre nükleofeksiyon kitinden 100 μL karışık nükleofeksiyon çözeltisi / takviyesi içinde karıştırın. Kitteki GFP kontrol plazmidini kullanın ve bir GFP kontrol plazmidi karışımı hazırlayın. NOT: Nükleofeksiyondan önce endotoksin kontaminasyonunu azaltmak için tüm plazmidlerin maxi-prep'inin yapılması önemlidir. Plazmidlerin konsantrasyonu yaklaşık 1 μg / μL olmalıdır.</li>
	<li>Hazırlanan hücreleri yeniden askıya almak ve herhangi bir kabarcıktan kaçınarak bir elektroporasyon küvetine (nükleofeksiyon kiti ile birlikte verilir) aktarmak için DNA karışımını (hacim ~ 111 μL) kullanın.</li>
	<li>İnsan pluripotent kök hücreleri için optimize edilmiş koşulları seçerek nükleofeksiyon cihazını kullanarak hücreleri elektroporat yapın. NOT: İnsan pluripotent kök hücreleri için nükleofeksiyon kitini ilk kez kullanıyorsanız, elektroporasyon programını test etmek ve en verimli olanı seçmek gerekir.</li>
	<li>Hemen elektroporatörlü hücrelere 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 37 °C mTeSR1 ortamına 500 μL taze ve ılık ekleyin. Karışımı, 3.2 ve 3.3 adımlarından hazırlanan 24 delikli bir plakanın 2 kuyucuğuna aktarın.</li>
	<li>Plakayı hızlı bir şekilde 37 °C / % 5 CO2 inkübatöre geri koyun ve hücrelerin iyileşmesine izin verin.</li>
	<li>12-16 saat sonra, hücre bakım ortamını değiştirin. Hücreler hücre-hücre teması kurarsa, ROCK inhibitörünü geri çekin, değilse, ortamı inhibitör ile desteklemeye devam edin.</li>
	<li>24-48 saat arasında, kontrol hücrelerindeki GFP ekspresyonunu inceleyerek nükleofeksiyon etkinliğini kontrol edin. GFP pozitif hücreler en az yüzde 30 olmalıdır.</li>
	<li>Nükleofeksiyondan 48 saat sonra, mTeSR1 ortamını 1 μg / mL puromisin ile destekleyerek hücreleri seçmeye başlayın.</li>
	<li>Nükleofeksiyondan 72 saat sonra, mTeSR1 ortamını 0.5 μg / mL puromisin ile destekleyin. Hücre akıcılığı% 30'dan düşükse, ortamı 10 μM ROCK inhibitörü ile de destekleyin.</li>
	<li>Nükleofeksiyondan 4-6 gün sonra, puromisine dirençli hücreleri 0.8 hücre / kuyu konsantrasyonunda 10-15 x 96 kuyucuklu plakalara geçirin. NOT: Ortamın 10 μM ROCK inhibitörü ve 0.5 μg / mL puromisin ile desteklenmesi esastır.</li>
	<li>Tek hücreden türetilmiş koloniler oluşturmak için bu hücreleri 10-12 gün boyunca 37 °C / % 10 CO 2'de tutun. Tohumlamadan 7 gün sonra bir kez orta doldurun. NOT: Artan CO2 seviyesi, deneyimlerimize göre tek hPSC'lerin koloniler oluşturmasına yardımcı olur.</li>
	<li>Tek bir koloni içeren kuyucukları işaretleyin ve ortamı 0.5 μg / mL puromisin içeren ancak ROCK inhibitörü içermeyen taze mTeSR1 ortamı ile değiştirin. NOT: Bu noktadan itibaren, hücreler 37 °C / % 5 CO2 altında büyüyecektir.</li>
	<li>İki gün sonra, farklılaşmamış koloniler içeren kuyular için ortamı değiştirin. Ortamı 10 μM ROCK inhibitörü ve 0.5 μg / mL puromisin ile destekleyin. NOT: Bazı kuyularda, hücreler farklılaşmış olabilir ve atılması gerekebilir.</li>
	<li>Kolonileri nazikçe kazımak için P2 pipet uçlarını kullanın. Bir koloniden türetilen hücre süspansiyonunu ayrı 96 kuyucuklu plakalar üzerinde 2 yeni kuyuya aktarın ve birini genotipleme, diğerini de bakım için kullanın. NOT: Kolonileri dikkatli bir şekilde korumak ve kendiliğinden farklılaşma seviyesini minimumda tutmak önemlidir.</li>
	<li>Genotipleme için hücreleri içeren plakayı, çoğu kuyucuktaki akıcılık% 50 veya daha fazlasına ulaştığında alın. Harcanan ortamı boşaltın ve ardından hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Bradley lizis tamponunu kullanarak hücreleri kuyuya alın ve ilişkili protokolü (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate) takiben plakadaki her kuyucuktan genomik DNA'yı izole edin.</li>
	<li>Hem sol hem de sağ homoloji kollarını bağımsız olarak10 genotiplemek için üç primer bağlantı PCR yöntemi kullanın. NOT: PCR yöntemini gösteren bir şema Şekil 2'de sunulmuştur.</li>
	<li>Sanger dizilimi için 4-5 koloniden her iki homoloji kolu için bağlantı PCR ürünlerini gönderin ve dizileri alın. NOT: Kurulan 2 koloninin sıralama sonucu Şekil 3A'da gösterilmiştir.</li>
	<li>Kolonileri doğru genotipte tutun ve gerisini atın.</li>
	<li>Sürekli puromisin seçimi altında doğru kolonileri genişletin ve mümkün olan en erken geçişte dondurun.</li>
</ol>4. Transpozonun hedeflenen insan pluripotent kök hücrelerinden çıkarılması
<ol><li>0.5 μg / mL puromisin seçimi altında doğru genotipe sahip bir koloni tutun.</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi 5 μg hiperaktif transpozaz (pCMV-hyPBase) içeren 8 x 105 ila 1 x 106 hücreli nükleofect (Bölüm 3, adım 3.4-3.18). Paralel olarak bir GFP kontrol nükleofeksiyonu gerçekleştirin. NOT: Puromisin, bu hücrelerin nükleofeksiyonundan hemen sonra mTeSR1 ortamından çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Yayınlanan prosedürlerin ardından çıkarılan puro-deltaTK seçim kaseti ile hücreleri büyütün ve tarayın10. NOT: Orijinal prosedürleri dikkatle takip etmek önemlidir. FIAU veya 1-(2-deoksi-2-floro-β-d-arabinofuranosil)-5-iyodourasil), Herpes simpleks virüsü kaynaklı timidin kinaz (HSV-tk) bazlı negatif seleksiyon için bir timidin analoğu olarak kullanılmıştır.</li>
	<li>Transpozonun çıkarılmasını onaylamak için değiştirilen bölgeyi sıralayın. NOT: Kurulan 3 koloninin sıralama sonucu Şekil 3B'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Kolonileri doğru genotipte tutun ve daha fazla kullanım için genişletin.</li>
	<li>Daha fazla analiz için kullanmadan önce seçilen kolonilerdeki pluripotens belirteçlerinin karakterizasyonunu gerçekleştirin. NOT: Kurulan iki koloninin karakterizasyonu Şekil 4'te gösterilmiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H, Stemnovate Limited'in kurucu ortağı, hissedarı ve yöneticisidir.

Burada açıklanan protokol, önceden belirlenmiş nokta mutasyonlarını hPSC'lerde endojen bir lokusa sokmak için kullanılabilir. Domuzcuk tabanlı bir hedefleme vektörü ve eşleştirilmiş CRISPR / Cas9n ekspresyon plazmidlerinin kombinasyonunun güvenilir ve verimli olduğu kanıtlandı11. HNF4α gen düzenlemesini takiben, analiz edilen 43 klondan 12'si, bağlantı PCR taraması ile belirlenen şekilde doğru bir şekilde hedeflenmiştir. Spesifik olarak, bialelik hedefleme etkinliği yaklaşık% 21 (9/43) ve monoalelik hedefleme verimliliği% 7 (3/43) civarındaydı.
Hedefleme deneylerini takiben, taramanın ilk turu sırasında hedeflenen lokusun piggyBac transpozazı için erişilebilir olmasını sağlamak için puromisin seçimini sürdürmek çok önemlidir. Bu, PGK promotör güdümlü puro-deltaTK seçim kasetinin susturulmasını en aza indirecek vetarama 10'un ikinci turunda arka planı azaltacaktır. Yakın tarihli bir rapor, CAG promotörünün susturulmaya karşı hPSC14'teki PGK promotöründen daha dirençli olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, seçim kaseti için promotörün değiştirilmesi gelecekte bu sistemi geliştirebilir. HiPBaz ve GFP transfekte hücrelerden dirençli kolonilerin sayısını karşılaştırmak da önemlidir. Transpozonun başarılı bir şekilde çıkarılmasından sonra, hipPBazdan GFP-transfekte hücrelerden daha fazla hayatta kalan koloni olmalıdır. Transpozon eksizyonunun PCR analizine ek olarak, eksizyon doğruluğunu doğrulamak için modifiye bölgenin doğrudan sıralanması gerekir.
Yusa'nın piggyBac transpozon tabanlı hedefleme vektörü stratejisi 9,10'a dayanarak, yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan prosedürler hPSC'lerin nükleofeksiyonunu ve tek hücre klonlama verimliliğini artırmaya odaklandı. Hücre tohumlama yoğunluğu, heterojen koloni oluşumu olasılığını azaltmak için optimize edilmiştir. Ayrıca, genotip taraması için koloni üretimini arttırmak için% 10 CO2'nin altında 10-12 günlük kültür kullandık. Deneyimlerimize göre, her 96 kuyucuklu plakadan yaklaşık 20 koloni elde edilebilir. Bu adım diğer yöntemlerden daha fazla zaman alabilse de, güvenilir ve oldukça verimlidir.
İhtiyaca bağlı olarak, hedefleme vektörleri, nokta mutasyonlarını tanıtmak veya düzeltmek, muhabir hücre çizgileri oluşturmak ve nakavt gen ekspresyonu oluşturmak için tasarlanabilir. Sonuç olarak, CRISPR / Cas9 (n) sisteminin ve bir hedefleme vektörünün kombinasyonu, farklı türlerde genetiği değiştirilmiş hPSC'ler sunmanın etkili bir yoludur.

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), araştırma veya klinik1 için sınırsız bir somatik hücre kaynağını temsil eder. hPSC'lerde gen hedefleme, hücre spesifikasyonu sırasında gen fonksiyonunu incelemek ve hastalık mekanizmalarını anlamak için güçlü bir yöntem sunar. Etkili genom düzenleme yöntemleri mevcut olmasına rağmen, hPSC'lerdeki genleri modifiye etmek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. hPSC'lerde homolog rekombinasyon ile standart gen hedeflemesi düşük frekansta gerçekleşir veya bazı genlerde bile tespit edilemez 2 ve DNA çift iplikçik kırılması (DSB) uyarılmış gen hedeflemesi (gen düzenleme olarak adlandırılır) bu nedenle bu hücrelerde gereklidir 2,3. Ek olarak, hPSC'lerin transfeksiyonu ve ardından tek hücreli klonlama, tek hücreyle ilişkili apoptoz, Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü4 kullanılarak azaltılabilse de, çok verimli değildir. Son olarak, ilgilenilen gendeki potansiyel hedef içi ve hedef dışı mutasyonlar da sorunlu olabilir. Bu nedenle, hPSC'lerde özel genetik değişiklikler yapmak için güvenilir bir protokol gereklidir.
RNA rehberliğindeki CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) ve CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) teknolojisi artık gen düzenlemede köklü bir araçtır. Transkribe edilmiş CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici bir RNA (tracrRNA), Cas9 proteini ile kompleksleşen ve genin spesifik bölünmesine izin veren tek kılavuzRNA'yı (sgRNA) oluşturur. CRISPR / Cas9 sistemi, sgRNA'nın 20-bp kılavuz dizisini değiştirerek programlanabilir, yani protospacer-bitişik motif (PAM) gereksinimini karşılayan hemen hemen her lokus düzenlenebilir. Bununla birlikte, vahşi tip Cas9, kılavuz dizisi ile bir DNA hedefi arasındaki bazı uyumsuzlukları tolere edebilir ve bu da istenmeyen hedef dışı etkilere neden olabilir. Özgüllüğünü arttırmak için, bir nickaz mutantı (Cas9n) geliştirilmiştir. D10A veya N863A mutasyonu içeren bir Cas9n sadece bir fonksiyonel nükleaz alanına sahiptir ve sonuç olarak DNA'yı sadece bir iplikçikte parçalayabilir. Uygun şekilde yerleştirilmiş ve yönlendirilmiş bir çift Cas9n, DNA DSB'yi etkili bir şekilde indükleyebilir ve hedef dışı etkiler önemli ölçüde azalır6. Verimli Cas9n modifikasyonu sağlamak için, iki Cas9n-sgRNA'nın ideal olarak -4 ila 20 bp ofset ile yerleştirilmesi ve her zaman 5' çıkıntı6 oluşturması gerektiği gösterilmiştir.
Cas9(n)-sgRNA ile indüklenen DSB, hPSC'lerde genom düzenleme için kullanılabilir 7,8. Homolog olmayan uç birleştirme onarımı yoluyla gen nakavtı oluşturabilir veya bir donör DNA şablonu mevcutsa, homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla gen modifikasyonu yapabilir. Burada açıklanan protokol, HDR için bir piggyBac transpozon bazlı donör plazmidi (veya hedefleme vektörü) kullanır, burada bir ilaç direnci belirteci transpozon ters çevrilmiş tekrarlarla çevrilidir. Bu yaklaşımın avantajı, ilk olarak Yusa ve ark.9,10 tarafından gösterildiği gibi verimli tarama ve kesintisiz gen düzenlemeyi içerir. İlaç seçim kaseti, hücrelerin entegre vektörle zenginleştirilmesine izin verir, bunlar daha sonra HDR tarafından türetilenleri tanımlamak için bağlantı PCR ile taranır. Ek olarak, ilaç seçim kaseti Cas9 (n) bölünmesi için hedef dizilerin yerini alacak şekilde konumlandırılabilir, böylece HDR'den sonra başka DNA kırılması meydana gelmez, böylece Cas9 (n) yeniden bölünmesinden kaynaklanan 'açık' hedef mutasyonları ortadan kaldırır. Ayrıca, piggyBac transpozaz tarafından katalize edilen hassas eksizyondan yararlanarak, seçim belirteci daha sonra bir yara izi bırakmadan genomdan eksize edilir. İlaç seçim belirteci9'un çıkarılmasından sonra sadece piggyBac yerleştirme için orijinal endojen TTAA dizisi kalır. TTAA sitelerinin ikameler getirilerek oluşturulması gerekse bile, rahatsız edici düzenleyici unsurların olasılığı diğer yöntemlere kıyasla azalır10.
Burada, hPSC'lerde kesintisiz genom düzenlemeyi uygulamak için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Domuzcuk bazlı bir donör plazmidini ve CRISPR-Cas9 nickaz mutantını iki aşamalı bir genetik seçilimde birleştirerek, hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) gen11'e önceden belirlenmiş iki nokta mutasyonu getirdik. Bu yaklaşım güvenilir ve verimlidir ve insan pluripotent kök hücrelerinden endoderm ve hepatosit spesifikasyonunda HNF4α'nın oynadığı önemli rollerin derinlemesineanalizine izin vermiştir 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

RNA rehberliğinde Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-Cas9 gibi özel olarak tasarlanmış endonükleazlar, memeli hücrelerinde etkili genom düzenlemesini mümkün kılar. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinde bir örnek olarak hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunu sorunsuz bir şekilde genom düzenlemesi için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Domuzcuk bazlı bir donör plazmidi ve CRISPR-Cas9 nickaz mutantını iki aşamalı bir genetik seçimde birleştirerek, HNF4α lokusunun doğru ve verimli bir şekilde hedeflendiğini gösteriyoruz.

Vektör tabanlı zincirleme stratejiyi hedefleme Hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) geni, ekzon 8'e iki noktalı mutasyonlar getirmek için hedeflenen genom düzenlemesi için seçildi. 11 bp ofsetli bir çift Cas9n-sgRNA, değiştirilecek bölgeye yakın bir yerde tasarlanmıştır. DomuzcukBac tabanlı hedefleme vektörü, istenen nokta mutasyonlarını tanıtmak için homolojiye yönelik onarım şablonu olarak çalıştı. Eş anlamlı nükleotid ikamelerini veya istenen nokta mutasyonlarını içeren bir 967 bp 5'-HA ve bir 1142 bp 3'-HA güçlendirildi ve nihai hedefleme vektörüne klonlandı. DomuzcukBac yerleştirme bölgesi, istenen iki nokta mutasyonundan 16 bp ve 22 bp uzaktaydı. İlk turda puro-deltaTK seçim kasetini içeren koloniler puromisin ile seçildi. Seçim kaseti ikinci turda transpozaz eksizyonu ile çıkarıldıktan sonra, hedeflenen bölge sadece gende dahil edilen istenen nokta mutasyonları ile sorunsuz bir şekilde değiştirildi (Şekil 1).
İnsan pluripotent kök hücrelerinde genetik düzenleme Doğru hedeflenmiş hücreleri taramak için, genotipleme için üç primer tabanlı bir PCR yöntemi kullanılmıştır (Şekil 2). PCR sonuçlarını doğrulamak için Sanger dizilimi uygulandı (Şekil 3A). Seçim kasetinin çıkarılmasından sonra, modifiye edilen bölge, istenen nokta mutasyonlarının doğru bir şekilde tanıtıldığını doğrulamak için tekrar sıralandı (Şekil 3B).
Koloni kurulması ve düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerinin karakterizasyonu Doğru genotipe sahip koloniler seçildi ve gerektiğinde genişletildi. Kurulan kolonilerin daha fazla analiz için kullanılmadan önce karakterize edilmesi gerekir. Düzenlenmiş hücreler, ebeveyn hücrelerle aynı morfolojiye sahiptir (Şekil 4A). Ayrıca, transkripsiyon faktörleri NANOG ve OCT4 (Şekil 4 B) ve ayrıca hücre yüzey belirteçleri SSEA4 ve TRA-1-60 (Şekil 4 C) dahil olmak üzere temsili insan pluripotent kök hücre belirteçlerini ifade ederler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Şekil 1: Vektör tabanlı zincirleme stratejiyi hedefleme11. HNF4α geninin ekzon 8'inde DNA çift iplikçik kırılmasını indüklemek için bir çift Cas9n-sgRNA ekspresyon plazmidi kullanıldı. 16 bp ve 22 bp uzaklıkta bulunan önceden belirlenmiş nokta mutasyonlarını tanıtmak için bir seçim kasetine sahip bir hedefleme vektörü kullanıldı. Bu seçim kaseti, yapısal olarak aktif bir promotör (PGK) tarafından tahrik edilen pozitif-negatif bir seçim işaretleyicisinden (puro-deltaTK) oluşan piggyBac transpozonu içinde yer alıyordu. Homolojiye yönelik onarım yolu aracılığıyla, hedeflenen hücreler seçim kasetini içeriyordu. Transpozazın aracılık ettiği transpozon eksizyonu, sadece nokta mutasyonlarının mevcut olduğu dikişsiz bir modifikasyonla sonuçlanır. Kızıl haç, istenen nokta mutasyonlarının yerini gösterir. HA = homoloji kolu; PB = piggyBac; PM = nokta mutasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Şekil 2: Üç primer tabanlı PCR yöntemi. Gen hedefli hücreleri taramak için PCR tabanlı genotipleme kullanıldı. Sol homoloji kol bölgesini büyütmek için üç primer, LA-F1, -R1 ve -R2 kullanıldı. Bağımsız olarak, sağ homoloji kol bölgesini yükseltmek için RA-F1, -F2 ve -R1 kullanıldı. Jel elektroforezi sonucuna dayanarak, hedeflenmemiş hücreler ile heterozigot ve homozigot hücreler birbirinden ayırt edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Şekil 3: Genetiği değiştirilmiş hücrelerin dizileme sonuçları11. İki klondan elde edilen PCR ürünleri sıralandı ve seçim kasetinin hedeflenen lokusa (A) doğru yerleştirildiği doğrulandı. 5' ve 3' piggyBac ters terminal tekrarları (ITR), TTAA doğrudan tekrarları tarafından kuşatıldı. Transpozon eksizyonu sonrası üç klon sıralandı (B). DNA çift iplikçik kırılmasını sağlamak için 11 bp ofsetli bir çift Cas9n-sgRNA kullanıldı. Önceden belirlenmiş iki nokta mutasyonu (A'dan G'ye ve A'dan C'ye) genin içine sokuldu. Eşanlamlı bir mutasyon, protospacer-bitişik motifi (PAM) mutasyona uğratmak için ve bir diğeri de piggyBac eksizyonu için gerekli TTAA bölgesini oluşturmak için tanıtıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Şekil 4: Düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerinin karakterizasyonu. Düzenlenmiş iki hücre çizgisinin ve ebeveyn hücrelerinin (A) morfolojisi, ölçek çubuğu = 100 μm. Pluripotent kök hücre belirteçleri NANOG ve OCT4'ün ekspresyonu, iki modifiye hücre hattında ve ebeveyn hücrelerde akış sitometrisi (C) ile SSEA4 ve TRA-1-60'a ek olarak immün boyama (B, ölçek çubuğu = 50 μm) ile incelenmiştir. IgG negatif kontrol olarak kullanıldı. DAPI, çekirdeği boyamak için kullanıldı. Yüzdeler, üç bağımsız deneyin ortalaması olarak hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

introducing-point-mutations-into-human-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

3.9K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Video: Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genetik

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...