pMCS-AAT_PB-PGKpuroTKおよびpCMV-hyPBaseプラスミドを共有してくださった遊佐浩介に感謝します。ゲノム編集に関する有益な議論をしてくれたJia-Yin Yang氏とKaramjit Singh-Dolt氏に感謝します。D.C.H.ラボは、チーフサイエンティストオフィス(TC/16/37)および英国再生医療プラットフォーム(MR/L022974/1)からの賞によってサポートされています。Y.W.は、中国奨学金評議会とエジンバラ大学が資金提供する博士課程の奨学金によって支援されました。

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA発現プラスミドの設計と構築
<ol><li>改変部位付近の5'-NGGのすぐ上流にある20 bpのガイド配列を検索します。 化膿レンサ 球菌由来のCas9ニッカーゼ(Cas9n)を使用する場合は、一対のシングルガイドRNA(sgRNA)が必要です。sgRNAのペアは、-4〜20 bpのオフセット6でニッキング時に5'のオーバーハングを生成できなければなりません。</li>
	<li>必要なオリゴとpSpCas9n-2A-プロベクターを注文します。</li>
	<li>sgRNAをpSpCas9nベクターにクローニングして、公開されたプロトコル12に従ってCas9nと共発現させる。</li>
</ol>2. piggyBacベースのターゲティングベクターの設計と構築
<ol><li>標的遺伝子配列をダウンロードし、改変部位付近のTTAA部位を検索する。 注: TTAA サイトと変更予定サイトの間の距離は、できるだけ短くする必要があります。コード配列内で、100-bp以内にTTAA部位が存在しない場合は、同義ヌクレオチド置換を行って導入する必要がある。</li>
	<li>ホモロジーアーム(HA)を設計し、HAに目的の点変異を組み込みます。HA の最適な長さは、約 500 〜 1200 bp である必要があります。 注:Cas9nの再切断の可能性を回避するために、PAM配列を変異させるために同義のヌクレオチド置換を導入することをお勧めします。</li>
	<li>確立されたプロトコル10に従って最終的なターゲティングベクトルを構築する。 注:ここで使用されるターゲティングベクターでは、PGKプロモーター駆動のpuro-deltaTK選択カセットがトランスポゾン反転リピートによって隣接されています。</li>
</ol>3. ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集
<ol><li>ヒト多能性幹細胞(hPSC)を加湿インキュベーター内で37°C、組換えラミニン521コーティング表面(5 μg/mL)の5%CO2 をmTeSR1培地13に維持します。細胞は、1:3の分割比の後、72時間後に70〜85%のコンフルエントに達するはずです。 注:存在する場合は、毎日の培地交換の前に、自然に分化した細胞を穏やかに吸引して取り除きます。</li>
	<li>トランスフェクション当日、24 ウェルプレートのウェルに 300 μL のラミニン 521 溶液 (5 μg/mL) を 37 °C で 2 時間以上コーティングします。</li>
	<li>コーティング溶液を穏やかに除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した300 μLの新鮮なmTeSR1培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻して細胞を受け取ります。 注意: ラミニンコーティング溶液を除去するときは、プレートを乾燥させないでください。</li>
	<li>ストックhPSCをインキュベーターから移動し、使用済み培地を除去してから、1 mLの滅菌1x DPBSを使用して細胞を1回洗浄します。</li>
	<li>穏やかな細胞解離試薬1 mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cで6〜8分間インキュベートして細胞を解離させます。 注意: プレートを軽くたたき、細胞が簡単に剥がれるかどうかを確認して、消化が十分に長いかどうかを判断します。</li>
	<li>P1000チップを使用してゆっくりと上下にピペットで動かし、すべてのhPSCを持ち上げます。</li>
	<li>10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地を細胞懸濁液に加えて解離を終了します。</li>
	<li>よく混合し、単一細胞懸濁液を50 mLチューブに移し、室温で200 x g で3分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地に細胞をよく再懸濁します。</li>
	<li>血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。トリパンブルーを使用して、死んだ細胞を染色して除外します。</li>
	<li>8 x 10 5から1 x 106生細胞を各ヌクレオフェクション反応のために1.5 mLチューブに移し、200 x gで3分間遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引します。</li>
	<li>3 μgのペアCas9n-sgRNA発現プラスミドと5 μgのターゲティングベクタープラスミドを、ヒト幹細胞核効果キットの100 μLの混合ヌクレオフェクション溶液/サプリメントに混合します。キットのGFPコントロールプラスミドを使用し、GFPコントロールプラスミドミックスも調製します。 注:核代謝前のエンドトキシン汚染を減らすために、すべてのプラスミドのマキシプレップを行うことが重要です。プラスミドの濃度は約1 μg/μLである必要があります。</li>
	<li>DNAミックス(容量~111 μL)を使用して、調製した細胞を再懸濁し、気泡を避けてエレクトロポレーションキュベット(ヌクレオフェクションキットに付属)に移します。</li>
	<li>ヒト多能性幹細胞に最適化された条件を選択することにより、核オフフェクションデバイスを使用して細胞をエレクトロポレーションします。 注:ヒト多能性幹細胞用の核効果キットを初めて使用する場合は、エレクトロポレーションプログラムをテストし、最も効率的なものを選択する必要があります。</li>
	<li>10 μM ROCK阻害剤を添加した37°CのmTeSR1培地に、新鮮で温かい500 μLをエレクトロポレーション細胞に直ちに加えます。ステップ3.2および3.3で調製した24ウェルプレートの2ウェルにミックスを移します。</li>
	<li>プレートを37°C/5%CO2 インキュベーターにすばやく戻し、細胞を回復させます。</li>
	<li>12〜16時間後、細胞維持培地を交換します。細胞が細胞間接触を確立した場合は、ROCK阻害剤を回収し、そうでない場合は、阻害剤を培地に補充し続ける。</li>
	<li>24〜48時間の間に、コントロール細胞におけるGFP発現を調べることにより、核オフ化効率を確認する。GFP陽性細胞は少なくとも30%でなければなりません。</li>
	<li>ニュークレオフェクションの48時間後、mTeSR1培地に1 μg/mLのピューロマイシンを添加して細胞の選択を開始します。</li>
	<li>ヌクレオフェクションの72時間後、mTeSR1培地に0.5 μg/mLのピューロマイシンを補充します。細胞コンフルエントが30%より低い場合は、10 μM ROCK阻害剤も培地に補給します。</li>
	<li>ヌクレオフェクション後4〜6日で、ピューロマイシン耐性細胞を0.8細胞/ウェルの濃度で10〜15 x 96ウェルプレートに継代します。 注:培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補給することが不可欠です。</li>
	<li>これらの細胞を37°C/10%CO2で10〜12 日間維持して、単一細胞由来のコロニーを形成します。播種後7日で培地を補充する。 注:CO2 レベルの上昇は、私たちの経験から単一のhPSCがコロニーを形成するのに役立ちます。</li>
	<li>単一コロニーを含むウェルにマークを付け、培地を0.5 μg/mLのピューロマイシンを含むがROCK阻害剤を含まない新鮮なmTeSR1培地に置き換えます。 注:この時点から、細胞は37°C / 5%CO2の下で成長します。</li>
	<li>2日後、未分化コロニーを含むウェルの培地を交換した。培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補充します。 注:一部のウェルでは、細胞が分化している可能性があり、廃棄する必要があります。</li>
	<li>P2ピペットチップを使用して、コロニーをやさしくこすり落とします。1つのコロニーに由来する細胞懸濁液を別々の96ウェルプレート上の2つの新しいウェルに移し、1つはジェノタイピングに、もう1つは維持に使用します。 注:コロニーを注意深く維持し、自然分化レベルを最小限に抑えることが重要です。</li>
	<li>ほとんどのウェルのコンフルエントが50%以上に達したら、ジェノタイピング用の細胞を含むプレートを取り出します。使用済みの培地を捨ててから、DPBSで細胞を一度洗浄します。</li>
	<li>Bradley溶解バッファーを使用してウェル内の細胞を溶解し、関連するプロトコルに従ってプレート内の各ウェルからゲノムDNAを分離します(https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate)。</li>
	<li>3プライマージャンクションPCR法を用いて、左右両方の相同性アームを独立して遺伝子型決定する10。 注:PCR法を示すスキームを 図2に示します。</li>
	<li>サンガーシーケンシングのために4〜5コロニーから両方の相同性アームのジャンクションPCR産物を送り、配列を取得します。 注:2つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Aに示します。</li>
	<li>正しい遺伝子型のコロニーを保持し、残りを破棄します。</li>
	<li>連続的なピューロマイシン選択の下で正しいコロニーを拡大し、可能な限り早い継代でそれらを凍結する。</li>
</ol>4. 標的ヒト多能性幹細胞からのトランスポゾン除去
<ol><li>正しい遺伝子型のコロニーを 1 つ 0.5 μg/mL ピューロマイシン選択下に維持します。</li>
	<li>上記のように5μgの高活性トランスポザーゼ(pCMV-hyPBase)を有するNucleofect 8 x 105 〜1x 10 6 細胞(セクション3、ステップ3.4〜3.18)。GFP制御の核反応を並行して行います。 注:ピューロマイシンは、これらの細胞を核放出した直後にmTeSR1培地から除去する必要があります。</li>
	<li>公開された手順に従ってpuro-deltaTK選択カセットを取り外した細胞を増殖させ、スクリーニングします10. 注意: 元の手順に注意深く従うことが重要です。FIAU、または1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードラシル)は、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSV-tk)ベースのネガティブセレクションのチミジン類似体として使用されました。</li>
	<li>修飾領域を配列決定し、トランスポゾンの除去を確認する。 注:3つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Bに示します。</li>
	<li>コロニーを正しい遺伝子型で保持し、さらなる使用のために拡張します。</li>
	<li>選択したコロニーの多能性マーカーの特性評価を実行してから、さらなる分析に使用します。 注:2つの確立されたコロニーの特性評価を 図4に示します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.Hは、Stemnovate Limitedの共同創設者、株主、取締役です。

本明細書に記載されるプロトコルは、hPSCの内因性遺伝子座に所定の点突然変異を導入するために使用することができる。 piggyBacベースのターゲティングベクターとペアのCRISPR/Cas9n発現プラスミドの組み合わせは、信頼性が高く効率的であることが証明されました11。HNF4α遺伝子編集後、解析された43クローンのうち12クローンが、ジャンクションPCRスクリーニングによって決定されたとおりに正しく標的化されました。具体的には、バイアレルターゲティング効率は約21%(9/43)、モノアレルターゲティング効率は約7%(3/43)でした。
ターゲティング実験の後、スクリーニングの最初のラウンド中に標的遺伝子座を piggyBac トランスポザーゼにアクセスできるようにするために、ピューロマイシンの選択を維持することが重要です。これにより、PGKプロモーター駆動のピューロデルタTK選択カセットのサイレンシングが最小限に抑えられ、スクリーニング10の第2ラウンドのバックグラウンドが減少します。最近の報告では、hPSCにおいてCAGプロモーターがPGKプロモーターよりもサイレンシングに対して耐性が高いことが示されました14。したがって、選択カセットのプロモーターを変更することで、将来的にこのシステムが改善される可能性があります。また、hyPBaseトランスフェクト細胞とGFPトランスフェクト細胞からの耐性コロニーの数を比較することも重要です。トランスポゾンの除去に成功すると、GFPトランスフェクト細胞よりもhyPBaseからの生存コロニーが多くなるはずです。トランスポゾン切除のPCR分析に加えて、切除の忠実度を確認するために、修飾領域の直接シーケンシングが必要です。
YusaのpiggyBacトランスポゾンベースのターゲティングベクター戦略9,10に基づいて、上記の手順は、hPSCの核代謝および単一細胞クローニング効率の改善に焦点を当てた。細胞播種密度は、不均一なコロニー形成の可能性を低減するように最適化されました。また、遺伝子型スクリーニングのためのコロニー産生を強化するために、10%CO2下で10〜12日間の培養を採用しました。私たちの経験では、各96ウェルプレートから約20のコロニーを得ることができました。この手順は他の方法よりも時間がかかる場合がありますが、信頼性が高く、非常に効率的です。
必要に応じて、点突然変異の導入または修正、レポーター細胞株の作成、および遺伝子発現のノックアウトを行うターゲティングベクターを設計することができます。結論として、CRISPR/Cas9(n)システムとターゲティングベクターの組み合わせは、異なるタイプの遺伝子組み換えhPSCを送達するための効率的な方法です。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、研究または診療所のための体細胞の無制限の供給源を表しています1。hPS細胞における遺伝子ターゲティングは、細胞仕様中の遺伝子機能を研究し、疾患のメカニズムを理解するための強力な方法を提供します。効率的なゲノム編集法は存在しますが、hPS細胞の遺伝子を改変することは技術的に困難なままです。hPSCにおける相同組換えによる標準的な遺伝子ターゲティングは、低頻度で起こるか、一部の遺伝子では検出できないことさえあり2、したがって、これらの細胞ではDNA二本鎖切断(DSB)刺激遺伝子ターゲティング(遺伝子編集と呼ばれる)が必要である2,3。さらに、hPSCのトランスフェクションとそれに続くシングルセルクローニングは、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を使用することで単一細胞関連アポトーシスを低減できるにもかかわらず、あまり効率的ではありません4。最後に、目的の遺伝子における潜在的なオンターゲットおよびオフターゲット変異も問題となる可能性があります。したがって、hPSCに調整された遺伝的変化を行うには、信頼できるプロトコルが不可欠です。
RNAガイドCRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復)およびCRISPR関連タンパク質9(Cas9)テクノロジーは、現在、遺伝子編集において確立されたツールです。転写されたCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化RNA(tracrRNA)は、Cas9タンパク質と複合体を形成して遺伝子特異的切断を可能にするシングルガイドRNA(sgRNA)を形成します5。CRISPR/Cas9システムは、sgRNAの20 bpガイド配列を変更することでプログラム可能であり、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)要件を満たすほぼすべての遺伝子座を編集することができます。ただし、野生型Cas9は、そのガイド配列とDNAターゲットとの間のいくつかの不一致を許容することができ、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があります。その特異性を向上させるために、ニッカーゼ変異体(Cas9n)が開発されました。D10AまたはN863A変異を含むCas9nは、1つの機能的なヌクレアーゼドメインしか持たず、その結果、1本の鎖上のDNAしか切断できません。適切な間隔と配向のCas9nのペアは、DNA DSBを効果的に誘導することができ、オフターゲット効果は劇的に減少します6。効率的なCas9n修飾を確実にするために、2つのCas9n-sgRNAを理想的には-4〜20 bpのオフセットで配置し、常に5'オーバーハング6を作成する必要があることが示されています。
Cas9(n)-sgRNA誘導性DSBは、hPSCのゲノム編集に利用できます7,8。非相同末端結合修復を介して遺伝子ノックアウトを作成したり、ドナーDNAテンプレートが存在する場合は相同性指向修復(HDR)を介して遺伝子改変を導入したりすることができます。ここで説明するプロトコルは、HDR用のpiggyBacトランスポゾンベースのドナープラスミド(またはターゲティングベクター)を使用し、薬剤耐性マーカーがトランスポゾン反転リピートによって隣接している。このアプローチの利点には、Yusaらによって最初に実証されたように、効率的なスクリーニングとシームレスな遺伝子編集が含まれます9,10。薬物選択カセットは、統合されたベクターで細胞を濃縮することを可能にし、その後、ジャンクションPCRによってスクリーニングされ、HDRによって誘導されたものを同定する。さらに、薬物選択カセットは、Cas9(n)切断のターゲット配列を置き換えるように配置できるため、HDR後にそれ以上のDNA切断は発生せず、Cas9(n)再切断に起因する「オンターゲット」変異を排除します。さらに、piggyBacトランスポザーゼによって触媒される正確な切除を利用することにより、選択マーカーは瘢痕を残さずにゲノムから切除されます。piggyBac挿入のための元の内因性TTAA配列のみが、薬物選択マーカー9の除去後に残る。置換を導入することによってTTAAサイトを作成する必要がある場合でも、規制要素を乱す可能性は他の方法と比較して減少します10。
ここでは、hPSCにおけるシームレスなゲノム編集を実装するための詳細な手順について説明します。 PiggyBacベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニッカーゼ変異体を2段階の遺伝子選択で組み合わせ、肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子11に2つの所定の点変異を導入しました。このアプローチは信頼性が高く効率的であり、ヒト多能性幹細胞の内胚葉および肝細胞の仕様においてHNF4αが果たす重要な役割の詳細な分析を可能にしました11。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

RNAガイド下クラスター化規則的間隔短回文反復(CRISPR)-Cas9などのカスタム設計のエンドヌクレアーゼは、哺乳類細胞での効率的なゲノム編集を可能にします。ここでは、ヒト多能性幹細胞における肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座を例としてシームレスにゲノム編集するための詳細な手順を記載する。 piggyBacベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニッカーゼ変異体を2段階の遺伝子選択で組み合わせることで、HNF4α遺伝子座の正確かつ効率的なターゲティングを実証します。

ターゲティングベクトルベースのノックイン戦略 肝細胞核因子4アルファ(HNF4α)遺伝子は、エクソン8に2点変異を導入するための標的ゲノム編集のために選択されました。11 bpオフセットを有するCas9n-sgRNAのペアを、修飾する部位の近くに設計した。 piggyBacベースのターゲティングベクターは、所望の点突然変異を導入するための相同性指向修復テンプレートとして機能した。同義ヌクレオチド置換または所望の点変異を組み込んだ967 bp 5'-HAおよび1142 bp 3'-HAを増幅し、最終ターゲティングベクターにクローニングした。 piggyBac 挿入部位は、2つの所望の点突然変異から16bpおよび22bp離れていた。ピューロデルタTK選択カセットを含むコロニーを、第1ラウンドでピューロマイシンで選択した。2回目のトランスポザーゼ切除によって選択カセットが除去されると、標的部位は、遺伝子に組み込まれた所望の点突然変異のみでシームレスに改変されました(図1)。
ヒト多能性幹細胞における遺伝子編集 正しく標的とされた細胞をスクリーニングするために、ジェノタイピングに3つのプライマーベースのPCR法を使用しました(図2)。PCR結果を確認するためにサンガーシーケンシングを行った(図3A)。選択カセットの除去後、改変領域を再度配列決定し、所望の点突然変異の正しい導入を確認した(図3B)。
編集されたヒト多能性幹細胞のコロニー樹立と特性評価 正しい遺伝子型を有するコロニーを選択し、必要に応じて拡大した。確立されたコロニーは、さらなる分析に使用する前に特徴付ける必要があります。編集された細胞は、親細胞と同じ形態を有する(図4A)。それらはまた、転写因子NANOGおよびOCT4(図4 B)、ならびに細胞表面マーカーSSEA4およびTRA-1-60(図4C)を含む代表的なヒト多能性幹細胞マーカーを発現する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> 図1:ターゲティングベクターベースのノックイン戦略11. 一対のCas9n-sgRNA発現プラスミドを用いて、HNF4α遺伝子のエクソン8におけるDNA二本鎖切断を誘導した。選択カセットを有するターゲティングベクターを用いて、16bpおよび22bp離れた位置に位置する所定の点変異を導入した。この選択カセットは、構成的に活性なプロモーター(PGK)によって駆動されるポジティブ-ネガティブ選択マーカー(puro-deltaTK)からなる piggyBac トランスポゾン内に含まれていました。相同性指向修復経路を介して、標的細胞は選択カセットを組み込んだ。トランスポザーゼによって媒介されるトランスポゾン切除は、点突然変異のみが存在するシームレスな修飾をもたらす。赤十字は、目的の点突然変異の位置を示します。HA = 相同性アーム;PB = ピギーバック;PM =点突然変異。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> 図2:3つのプライマーベースのPCR法。 遺伝子標的細胞をスクリーニングするために、PCRベースのジェノタイピングが使用されました。3つのプライマー、LA-F1、-R1および-R2を用いて、左相同性アーム領域を増幅した。独立して、RA-F1、-F2および-R1を用いて、右相同性アーム領域を増幅した。ゲル電気泳動結果に基づいて、非標的細胞、ならびにヘテロ接合細胞およびホモ接合細胞を、互いに区別した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> 図3:遺伝子改変細胞の配列決定結果11. 2つのクローンからのPCR産物を配列決定し、標的遺伝子座(A)における選択カセットの正しい挿入を確認した。5'および3' のpiggyBac 逆ターミナルリピート(ITR)は、TTAAダイレクトリピートに隣接していました。3つのクローンをトランスポゾン切除後に配列決定した(B)。11 bpオフセットを有するCas9n-sgRNAのペアを使用して、DNA二本鎖切断を導入しました。2つの所定の点突然変異(AからGおよびAからC)を遺伝子に導入した。1つの同義変異は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を変異させるために導入され、もう1つは piggyBac 切除に必要なTTAA部位を作成するために導入されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> 図4:編集されたヒト多能性幹細胞の特性評価。 2つの編集された細胞株と親細胞(A)の形態は、スケールバー=100μmである。多能性幹細胞マーカーNANOGおよびOCT4の発現を免疫染色により調べ(B、スケールバー=50μm)、フローサイトメトリーによるSSEA4およびTRA-1-60に加えて(C)2つの改変細胞株および親細胞とした。陰性対照としてIgGを用いた。DAPIは核を染色するために使用されました。百分率は、3つの独立した実験の平均として計算した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

ここで、 piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を用いたヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集のための詳細な方法について述べる。ヒト胚性幹細胞(hESC)の肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座のエクソン8に2点変異を導入した。

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

3.9K ビュー.  University of Edinburgh. ここで、 piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を用いたヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集のための詳細な方法について述べる。ヒト胚性幹細胞(hESC)の肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座のエクソン8に2点変異を導入した。

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Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

遺伝学

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR を介したゲノム人間病原菌カンジダの編集

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...