Agradecemos a Kosuke Yusa por compartir los plásmidos pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK y pCMV-hyPBasa. Agradecemos a Jia-Yin Yang y Karamjit Singh-Dolt por sus útiles discusiones sobre la edición del genoma. El laboratorio D.C.H. está respaldado por un premio de la Oficina Científica Jefe (TC / 16/37) y la Plataforma de Medicina Regenerativa del Reino Unido (MR / L022974 / 1). Y.W. fue apoyado por una beca de doctorado financiada por el Consejo de Becas de China y la Universidad de Edimburgo.

1. Diseño y construcción de plásmidos de expresión CRISPR/Cas9n-sgRNA
<ol><li>Busque secuencias de guía de 20 pb directamente aguas arriba de cualquier 5'-NGG cerca del sitio que se va a modificar. Se necesita un par de ARN de guía única (sgRNAs) cuando se usa la nickasa Cas9 (Cas9n) de Streptococcus pyogenes . El par de sgRNAs debe ser capaz de generar voladizos de 5' al cortar con un desplazamiento de -4 a 20 pb6.</li>
	<li>Ordene los oligos necesarios y el vector pSpCas9n-2A-puro.</li>
	<li>Clone sgRNA en el vector pSpCas9n para la coexpresión con Cas9n siguiendo el protocolo publicado12.</li>
</ol>2. Diseño y construcción de un vector de focalización basado en piggybac
<ol><li>Descargue la secuencia del gen diana y busque un sitio TTAA cerca del sitio que se va a modificar. NOTA: La distancia entre el sitio TTAA y el sitio que se va a modificar debe ser lo más pequeña posible. Si dentro de la secuencia codificante y no hay un sitio TTAA presente dentro de la distancia de 100 pb, es necesario introducir uno haciendo sustituciones de nucleótidos sinónimos.</li>
	<li>Diseñar brazos de homología (HA) e incorporar las mutaciones puntuales deseadas en los HA. La longitud óptima de las HA debe ser de alrededor de 500 - 1200 pb. NOTA: Se recomienda introducir sustituciones de nucleótidos sinónimos para mutar la secuencia PAM con el fin de evitar la posible escisión de Cas9n.</li>
	<li>Construir el vector de focalización final siguiendo un protocolo establecido10. NOTA: En el vector de focalización utilizado aquí, un casete de selección puro-deltaTK impulsado por un promotor PGK está flanqueado por repeticiones invertidas de transposón.</li>
</ol>3. Edición genética de células madre pluripotentes humanas
<ol><li>Mantener células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2 en superficies recombinantes recubiertas de laminina 521 (5 μg/mL) en medio mTeSR113. Las células deben alcanzar una confluencia del 70-85% después de 72 horas siguiendo una proporción de división de 1:3. NOTA: Si está presente, retire las células espontáneamente diferenciadas antes del cambio diario del medio aspirándolas suavemente.</li>
	<li>El día de la transfección, cubrir los pocillos suficientes de una placa de 24 pocillos con 300 μL de la solución de laminina 521 (5 μg/ml) a 37 °C durante al menos 2 h.</li>
	<li>Retire la solución de recubrimiento suavemente y agregue 300 μL de medio mTeSR1 fresco suplementado con un inhibidor ROCK de 10 μM a cada pocillo, y luego vuelva a colocar la placa en la incubadora para recibir células. NOTA: No permita que las placas se sequen en ningún momento cuando se retire la solución de recubrimiento de laminina.</li>
	<li>Retire las hPSC de stock de la incubadora, retire el medio gastado y luego lave las células una vez usando 1 ml de 1x DPBS estéril.</li>
	<li>Añadir 1 ml de reactivo de disociación celular suave a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar a 37 °C durante 6-8 min para disociar las células. NOTA: Golpee suavemente la placa y verifique si las células pueden desprenderse fácilmente para decidir si la digestión es lo suficientemente larga.</li>
	<li>Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta P1000 para levantar todas las hPSC.</li>
	<li>Terminar la disociación añadiendo 2 ml de medio mTeSR1 fresco suplementado con 10 μM inhibidor de ROCK (Y-27632) a la suspensión celular.</li>
	<li>Mezclar bien y transferir la suspensión de una sola celda a un tubo de 50 ml, y centrifugar a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda bien las células en medio mTeSR1 fresco de 2 ml suplementado con un inhibidor ROCK de 10 μM.</li>
	<li>Contar las células viables usando un hemocitómetro. Use Trypan Blue para teñir y excluir las células muertas.</li>
	<li>Transfiera 8 x 105 a 1 x 106 células vivas a un tubo de 1,5 ml para cada reacción de nucleofección y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Mezclar 3 μg de plásmidos de expresión de Cas9n-sgRNA pareados y 5 μg de plásmido vectorial objetivo en 100 μL de solución/suplemento de nucleofección mixta del kit de nucleofección de células madre humanas. Utilice el plásmido de control GFP del kit y prepare también una mezcla de plásmidos de control GFP. NOTA: Es importante hacer una maxi-preparación de todos los plásmidos para reducir la contaminación por endotoxinas antes de la nucleofección. La concentración de los plásmidos debe ser de aproximadamente 1 μg/μL.</li>
	<li>Utilice la mezcla de ADN (volumen ~ 111 μL) para resuspender las células preparadas y transferirlas a una cubeta de electroporación (provista del kit de nucleofección), evitando cualquier burbuja.</li>
	<li>Electroporar las células utilizando el dispositivo de nucleofección seleccionando las condiciones optimizadas para las células madre pluripotentes humanas. NOTA: Si se utiliza el kit de nucleofección para células madre pluripotentes humanas por primera vez, es necesario probar el programa de electroporación y elegir el más eficiente.</li>
	<li>Añadir inmediatamente 500 μL de medio mTeSR1 fresco y caliente a 37 °C suplementado con inhibidor ROCK de 10 μM a las células electroporadas. Transfiera la mezcla a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos preparada a partir de los pasos 3.2 y 3.3.</li>
	<li>Vuelva a colocar rápidamente la placa en la incubadora deCO2 a 37 °C/5% y permita que las células se recuperen.</li>
	<li>12-16 h más tarde, cambie el medio de mantenimiento de la celda. Si las células establecieron contacto célula-célula, retirar el inhibidor de ROCK, si no, continuar complementando el medio con el inhibidor.</li>
	<li>Entre 24-48 h, comprobar la eficacia de la nucleofección examinando la expresión de GFP en las células de control. Las células GFP positivas deben ser al menos 30 por ciento.</li>
	<li>48 h después de la nucleofección, comience a seleccionar células complementando el medio mTeSR1 con 1 μg/ml de puromicina.</li>
	<li>72 h después de la nucleofección, complementar el medio mTeSR1 con 0,5 μg/ml de puromicina. Si la confluencia celular es inferior al 30%, también complemente el medio con un inhibidor ROCK de 10 μM.</li>
	<li>4-6 días después de la nucleofección, pasar las células resistentes a la puromicina a placas de 10-15 x 96 pocillos a la concentración de 0,8 células/pocillo. NOTA: Es esencial complementar el medio con un inhibidor ROCK de 10 μM y una puromicina de 0,5 μg/ml.</li>
	<li>Mantener esas células a 37 °C/10% de CO2 durante 10-12 días para formar colonias derivadas de células individuales. Rellene el medio una vez 7 días después de la siembra. NOTA: El aumento del nivel deCO2 ayuda a las hPSC individuales a formar colonias según nuestra experiencia.</li>
	<li>Marque los pocillos que contienen una sola colonia y reemplácelo con medio mTeSR1 fresco que contenga 0,5 μg/ml de puromicina pero sin inhibidor de ROCK. NOTA: A partir de este momento, las células se cultivarán por debajo de 37 °C / 5% deCO2.</li>
	<li>Dos días después, cambie el medio por pozos que contengan colonias indiferenciadas. Complementar el medio con 10 μM inhibidor de ROCK y 0,5 μg/ml de puromicina. NOTA: En algunos pozos, las células pueden haberse diferenciado y necesitar ser desechadas.</li>
	<li>Use puntas de pipeta P2 para raspar las colonias suavemente. Transfiera la suspensión celular derivada de una colonia a 2 nuevos pocillos en placas separadas de 96 pocillos, y use uno para genotipado y otro para mantenimiento. NOTA: Es importante mantener cuidadosamente las colonias y mantener el nivel de diferenciación espontánea al mínimo.</li>
	<li>Tome la placa que contiene células para genotipar una vez que la confluencia en la mayoría de los pozos alcanzó el 50% o más. Volque el medio gastado y luego lave las celdas una vez con DPBS.</li>
	<li>Lise las células en pozo usando tampón de lisis de Bradley y aísle el ADN genómico de cada pocillo en la placa siguiendo el protocolo asociado (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Utilizar un método de PCR de unión de tres cebadores para genotipar los brazos homólogos izquierdo y derecho de forma independiente10. NOTA: En la Figura 2 se presenta un esquema que muestra el método de PCR.</li>
	<li>Envíe los productos de PCR de unión para ambos brazos de homología de 4-5 colonias para la secuenciación de Sanger y obtenga las secuencias. NOTA: El resultado de la secuenciación de 2 colonias establecidas se muestra en la Figura 3A.</li>
	<li>Mantenga las colonias con el genotipo correcto y descarte el resto.</li>
	<li>Expandir las colonias correctas bajo selección continua de puromicina y congelarlas en el paso más temprano posible.</li>
</ol>4. Eliminación del transposón de células madre pluripotentes humanas dirigidas
<ol><li>Mantener una colonia con genotipo correcto por debajo de 0,5 μg/ml de selección de puromicina.</li>
	<li>Nucleofect 8 x 10 5 a 1 x 106 células con5 μg de transposasa hiperactiva (pCMV-hyPBasa) como se describió anteriormente (Sección 3, pasos 3.4-3.18). Realizar una nucleofección de control GFP en paralelo. NOTA: La puromicina debe eliminarse del medio mTeSR1 inmediatamente después de nucleofecar estas células.</li>
	<li>Cultivar y detectar células con el casete de selección puro-deltaTK eliminado siguiendo los procedimientos publicados10. NOTA: Es importante seguir cuidadosamente los procedimientos originales. FIAU, o 1-(2-desoxi-2-fluoro-β-d-arabinofuranosil)-5-yodouracilo), se utilizó como un análogo de timidina para la selección negativa basada en la timidina quinasa derivada del virus del herpes simple (HSV-tk).</li>
	<li>Secuencie la región modificada para confirmar la eliminación del transposón. NOTA: El resultado de la secuenciación de 3 colonias establecidas se muestra en la Figura 3B.</li>
	<li>Mantenga colonias con el genotipo correcto y amplíe para su uso posterior.</li>
	<li>Realizar la caracterización de los marcadores de pluripotencia en las colonias elegidas antes de utilizarlos para su posterior análisis. NOTA: La caracterización de dos colonias establecidas se muestra en la Figura 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H es cofundador, accionista y director de Stemnovate Limited.

El protocolo descrito en este documento se puede utilizar para introducir mutaciones puntuales predeterminadas en un locus endógeno en hPSCs. La combinación de un vector de focalización basado en piggyBac y plásmidos de expresión CRISPR/Cas9n pareados demostró ser fiable y eficiente11. Después de la edición del gen HNF4α, 12 de los 43 clones analizados se dirigieron correctamente según lo determinado por la detección de PCR de unión. Específicamente, la eficiencia de la focalización bialélica fue de aproximadamente el 21% (9/43) y la eficiencia de la focalización monoalélica fue de alrededor del 7% (3/43).
Después de los experimentos de focalización, es crucial mantener la selección de puromicina para mantener el locus objetivo accesible a la transposasa piggyBac durante la primera ronda de detección. Esto minimizará el silenciamiento del casete de selección puro-deltaTK impulsado por el promotor PGK y reducirá el fondo en la segunda ronda de selección10. Un informe reciente mostró que el promotor CAG es más resistente al silenciamiento que el promotor PGK en hPSCs14. Por lo tanto, cambiar el promotor para el casete de selección podría mejorar este sistema en el futuro. También es importante comparar el número de colonias resistentes de células transfectadas con hyPBasa y GFP. Tras la eliminación exitosa del transposón, debería haber más colonias sobrevivientes de las células transfectadas con hyPBasa que GFP. Además del análisis por PCR de la escisión de transposones, se requiere la secuenciación directa de la región modificada para confirmar la fidelidad de la escisión.
Basado enla estrategia de vector de focalización basada en transposones piggyBac de Yusa 9,10, los procedimientos detallados anteriormente se centraron en mejorar la nucleofección de hPSCs y la eficiencia de clonación de células individuales. La densidad de siembra celular se optimizó para reducir la probabilidad de formación de colonias heterogéneas. También empleamos un cultivo de 10-12 días por debajo del 10% deCO2 para mejorar la producción de colonias para el cribado de genotipos. En nuestra experiencia, se podrían obtener alrededor de 20 colonias de cada placa de 96 pocillos. Aunque este paso puede llevar más tiempo que otros métodos, es confiable y altamente eficiente.
Según la necesidad, los vectores dirigidos pueden diseñarse para introducir o corregir mutaciones puntuales, para crear líneas celulares reporteras, así como para la expresión génica knockout. En conclusión, la combinación del sistema CRISPR/Cas9(n) y un vector objetivo es una forma eficiente de administrar diferentes tipos de hPSC modificadas genéticamente.

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) representan una fuente ilimitada de células somáticas para la investigación o la clínica1. La orientación génica en las hPSC ofrece un método poderoso para estudiar la función de los genes durante la especificación celular y para comprender los mecanismos de la enfermedad. Aunque existen métodos eficientes de edición del genoma, la modificación de genes en hPSCs sigue siendo técnicamente un desafío. La focalización génica estándar por recombinación homóloga en hPSCs ocurre con baja frecuencia o incluso es indetectable en algunos genes 2, por lo que la segmentación génica estimulada por la ruptura de doble cadena del ADN (DSB) (denominada edición génica) es necesaria en estas células 2,3. Además, la transfección de hPSCs y la posterior clonación unicelular no es muy eficiente, aunque la apoptosis asociada a una sola célula puede reducirse mediante el uso del inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK)4. Finalmente, las posibles mutaciones en el objetivo y fuera del objetivo en el gen de interés también pueden ser problemáticas. Por lo tanto, un protocolo confiable es esencial para realizar cambios genéticos personalizados en las hPSC.
La tecnología CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) guiadas por ARN son ahora una herramienta bien establecida en la edición de genes. El ARN CRISPR transcrito (crRNA) y un ARN transactivador (tracrRNA) forman el ARN guía único (sgRNA), que se integra con la proteína Cas9 permitiendo la escisión específica del gen5. El sistema CRISPR/Cas9 es programable, cambiando una secuencia guía de 20 pb del sgRNA, lo que significa que se puede editar casi cualquier locus que cumpla con el requisito del motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Sin embargo, el tipo salvaje Cas9 puede tolerar algunos desajustes entre su secuencia guía y un objetivo de ADN, lo que podría causar efectos no deseados fuera del objetivo. Para mejorar su especificidad, se ha desarrollado un mutante de nickasa (Cas9n). Una mutación Cas9n que contiene D10A o N863A solo posee un dominio nucleasa funcional y, como resultado, solo puede cortar ADN en una hebra. Un par de Cas9n adecuadamente espaciados y orientados pueden inducir efectivamente ADN DSB y los efectos fuera del objetivo se reducen drásticamente6. Para garantizar una modificación eficiente de Cas9n, se ha demostrado que dos Cas9n-sgRNA idealmente deben colocarse con un desplazamiento de -4 a 20 pb y siempre crear un voladizo de 5'6.
El DSB inducido por Cas9(n)-sgRNA puede utilizarse para la edición del genoma en hPSCs 7,8. Puede crear un knockout de genes a través de la reparación de unión de extremos no homólogos, o introducir la modificación de genes a través de la reparación dirigida por homología (HDR) si hay una plantilla de ADN de donante. El protocolo descrito aquí utiliza un plásmido donante basado en transposón piggyBac (o vector objetivo) para HDR, en el que un marcador de resistencia a los medicamentos está flanqueado por las repeticiones invertidas del transposón. La ventaja de este enfoque incluye un cribado eficiente y una edición de genes sin fisuras, como lo demostraron por primera vez Yusa et al.9,10. El casete de selección de fármacos permite el enriquecimiento de las células con el vector integrado, que posteriormente son tamizadas por PCR de unión para identificar las derivadas por HDR. Además, el casete de selección de fármacos se puede colocar para reemplazar las secuencias objetivo para la escisión de Cas9 (n), de modo que no se produzca más rotura del ADN después de HDR, eliminando así las mutaciones objetivo "en" resultantes de la re-escisión de Cas9 (n). Además, al explotar la escisión precisa catalizada por la transposasa piggyBac, el marcador de selección se extirpa del genoma sin dejar cicatriz. Sólo queda la secuencia endógena original de TTAA para la inserción de piggyBac después de la eliminación del marcador de selección de fármacos9. Incluso si los sitios TTAA tienen que ser creados mediante la introducción de sustituciones, las posibilidades de perturbar los elementos regulatorios se reducen en comparación con otros métodos10.
Aquí describimos procedimientos detallados para implementar la edición perfecta del genoma en hPSC. Combinando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa CRISPR-Cas9 en una selección genética de dos pasos, introdujimos dos mutaciones puntuales predeterminadas en el gen11 del factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4α). Este enfoque es confiable y eficiente, y ha permitido analizar en profundidad el importante papel desempeñado por HNF4α en la especificación del endodermo y hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Las endonucleasas diseñadas a medida, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas9 guiadas por ARN, permiten una edición eficiente del genoma en células de mamíferos. Aquí describimos procedimientos detallados para editar sin problemas el genoma del locus del factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4α) como ejemplo en células madre pluripotentes humanas. Combinando un plásmido donante basado en piggybac y el mutante de nickasa CRISPR-Cas9 en una selección genética de dos pasos, demostramos una orientación correcta y eficiente del locus HNF4α.

Estrategia de knock-in basada en vectores El gen alfa del factor nuclear de hepatocitos 4 (HNF4α) se eligió para la edición dirigida del genoma para introducir dos mutaciones puntuales en el exón 8. Se diseñó un par de Cas9n-sgRNA con un desplazamiento de 11 pb cerca del sitio a modificar. El vector de orientación basado en piggyBac funcionó como la plantilla de reparación dirigida por homología para introducir las mutaciones puntuales deseadas. Un 967 pb 5'-HA y un 1142 pb 3'-HA incorporando sustituciones de nucleótidos sinónimos o las mutaciones puntuales deseadas fueron amplificados y clonados en el vector objetivo final. El sitio de inserción de piggyBac estaba a 16 pb y 22 pb de distancia de las dos mutaciones puntuales deseadas. Las colonias que contenían el casete de selección puro-deltaTK fueron seleccionadas con puromicina en la primera ronda. Una vez que el casete de selección se eliminó mediante escisión de transposasa en la segunda ronda, el sitio objetivo se modificó sin problemas con solo las mutaciones puntuales deseadas incorporadas en el gen (Figura 1).
Edición genética en células madre pluripotentes humanas Para detectar células correctamente dirigidas, se utilizó un método de PCR basado en tres cebadores para el genotipado (Figura 2). Se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar los resultados de la PCR (Figura 3A). Después de la retirada del casete de selección, la región modificada se secuenció nuevamente para confirmar la introducción correcta de las mutaciones puntuales deseadas (Figura 3B).
Establecimiento de colonias y caracterización de células madre pluripotentes humanas editadas Las colonias con el genotipo correcto fueron seleccionadas y expandidas según fuera necesario. Las colonias establecidas deben caracterizarse antes de ser utilizadas para un análisis posterior. Las células editadas poseen la misma morfología que las células parentales (Figura 4A). También expresan marcadores representativos de células madre pluripotentes humanas, incluidos los factores de transcripción NANOG y OCT4 (Figura 4 B), así como los marcadores de superficie celular SSEA4 y TRA-1-60 (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figura 1: Estrategia de knock-in basada en vectores11. Se utilizaron un par de plásmidos de expresión de Cas9n-sgRNA para inducir la ruptura de la doble cadena del ADN en el exón 8 del gen HNF4α. Se utilizó un vector de focalización con un casete de selección para introducir mutaciones puntuales predeterminadas localizadas a 16 pb y 22 pb de distancia. Este casete de selección estaba contenido dentro del transposón piggyBac , que consiste en un marcador de selección positivo-negativo (puro-deltaTK) impulsado por un promotor constitutivamente activo (PGK). A través de la vía de reparación dirigida por homología, las células objetivo incorporaron el casete de selección. La escisión de transposones mediada por transposasa da como resultado una modificación perfecta con solo las mutaciones puntuales presentes. La cruz roja indica la ubicación de las mutaciones puntuales deseadas. HA = brazo de homología; PB = piggyBac; PM = mutación puntual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figura 2: Método de PCR basado en tres cebadores. Para detectar las células dirigidas a genes, se utilizó genotipado basado en PCR. Se utilizaron tres cebadores, LA-F1, -R1 y -R2 para amplificar la región del brazo homólogo izquierdo. Independientemente, RA-F1, -F2 y -R1 se utilizaron para amplificar la región del brazo de homología derecha. Según el resultado de la electroforesis en gel, se distinguieron las células no diana y las células heterocigotas y homocigotas entre sí. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figura 3: Resultados de secuenciación de células modificadas genéticamente11. Se secuenciaron productos de PCR de dos clones y se confirmó la inserción correcta del casete de selección en el locus objetivo (A). Las repeticiones terminales invertidas (ITR) piggyBac de 5' y 3' estaban flanqueadas por las repeticiones directas TTAA. Tres clones fueron secuenciados después de la escisión de transposones (B). Se utilizó un par de Cas9n-sgRNA con un desplazamiento de 11 pb para introducir la ruptura de doble cadena del ADN. Se introdujeron dos mutaciones puntuales predeterminadas (A a G y A a C) en el gen. Se introdujo una mutación sinónimo para mutar el motivo adyacente al protoespaciador (PAM), y otra para crear el sitio TTAA necesario para la escisión de piggyBac . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figura 4: Caracterización de células madre pluripotentes humanas editadas. Morfología de dos líneas celulares editadas y las células parentales (A), barra de escala = 100 μm. La expresión de los marcadores de células madre pluripotentes NANOG y OCT4 se examinó mediante inmunotinción (B, barra de escala = 50 μm), además de SSEA4 y TRA-1-60 mediante citometría de flujo (C) en dos líneas celulares modificadas y en las células parentales. Se utilizó IgG como control negativo. DAPI se utilizó para teñir el núcleo. Los porcentajes se calcularon como el promedio de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

3.9K vistas.  University of Edinburgh. Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Video: Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Investigación

Genética

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Edición del genoma mediada por CRISPR el hongo patógeno Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...