פרוטוקול זה משתמש בשלוש גישות כדי לקבוע אם עשן סיגריות משפיע על עומס חיידקי pseudomonas בתאי אפיתל ריאות. ניתן להרחיב שיטה זו לתאי אנדותל או להקשות תאים אחרות. הכנת מיצוי עשן הסיגריות, זיהום חיידקי ונחישות עם עומס חיידקי מתוארים היטב בפירוט בסרטון זה.
הליך זה קל מאוד לעקוב אחר המשתמשים החדשים. צייר 10 מיליליטר של מדיום תרבות תאים ללא סרום למזרק 60 מיליליטר. חבר את הקצה הצר של חיתוך לקצה פיפיאט מיליליטר אחד אל הזרבובית של המזרק, כמתאם להחזיק את הסיגריה.
מוציאים את המסנן מהסיגריה ומצמידים את הסיגריה למתאם. לא יותר מ-30 דקות לפני ביצוע ההתלקחות, הבעירו את הסיגריה וציירו 40 מיליליטר של עשן המכיל אוויר לתוך המזרק. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי טלטול המזרק במרץ.
חזור על תהליך הציור עד הסיגריה נשרפת לחלוטין, אשר ידרוש כ 11 שואבת בערך שבע דקות. כדי להסיר מיקרואורגניזמים וחלקיקים בלתי מסיסים מהמדיום, סנן אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. לאחר מכן, מעבירים את המדיום לצינור סטרילי סגור.
לחסן מרק סויה טריפטי או צלחת auger TSB עם זן pseudomonas נבחר. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הכינו צינור המכיל 20 מיליליטר של TSB עם 5%גליצרול כמקור הפחמן.
לאסוף כתם מצלחת auger ולחסן את TSB. דגירה ההשעיה pseudomonas ב שייקר 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד, במשך כשעה, עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הוא 0.6. לאחר culturing תאי אפיתל ריאות כמתואר בכתב היד, להוסיף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין לתאים.
לאחר כחמש דקות, כאשר התאים התנתקו לחלוטין מתחתית הצלחת, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום גבהים שלם כדי לנטרל את טריפסין. העבר את התאים לצינור 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 300 פעמים G. הסר והשליך את העל-טבעי.
לאחר מכן, השהה מחדש את התאים למיליליטרים של מדיום הייטס עם 10%FBS. פיפטה 10 מיקרוליטרים של ההשעיה תא אפיתל על צלחת חדשה. השתמש מונה תאים אוטומטי כדי להשיג את ריכוז התא.
צלחת תאי אפיתל הריאות בריכוז של שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, בנפח כולל של שני מיליליטר של בינוני לגם. דגירה הצלחות לילה. כאשר התאים מגיעים ל- 80%confluency בקירוב, החלף את המדיה בגודל בינוני, בתוספת 1%FBS.
לאחר מכן, מוסיפים 4% CSE ל בארות לה הדגירה את הצלחות במשך שלוש שעות. הוסף pseudomonas לכל באר של תאי אפיתל ריאות שטופלו ב- CSE. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר מכן, החלף את המדיום בשש צלחות באר עם שני מיליליטר של מדיום גבהים טריים, המכיל 4% CSE ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של ג'נטמיצין. לאחר הדגירה של הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, שאפו את המדיום מה בארות. לשטוף את התאים שטופלו ג'נטמיצין, פעמיים, עם שני מיליליטר של PBS קר.
חיידקים לטעון בתאי אפיתל הריאה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי שיטת צלחת טיפה, qRT-PCR, או cytometry זרימה. הוסף מיליליטר אחד של מאגר תמיסת תאים לכל באר של תאי אפיתל ריאות. תקן דילולים טוריים של ליט התא, החל מאחד עד 10 לאחד עד 10, 000.
ואז לחסן את צלחת auger TSB. לאחר 16 שעות של דגירה, לקבוע כמה מושבה להרכיב יחידות היו נוכחים בתאי אפיתל הריאה, על ידי ספירת מספר המושבות החיידקיות. הוסף 0.35 מיליליטר של חיץ תמיסת תיוציאנט guanidinium לכל באר של תאי אפיתל ריאות.
לאסוף את התאים עם מגרד תאים. פיפטה ליסט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ומערבבים בעדינות עם פיפטה. מוסיפים 0.35 מיליליטר של טרי מוכן 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב.
העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור איסוף של שני מיליליטר. צנטריפוגה צינור האיסוף במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים G ו 20 עד 25 מעלות צלזיוס. השלך את המאגר בצינור האיסוף ושטף את העמודה עם 0.7 מיליליטר של חיץ שטיפה.
צנטריפוגה הטור ב 10, 000 פעמים G במשך 30 שניות. לשטוף את העמודה פעמיים עם 0.5 מיליליטר של חיץ. חזור על הצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שתי דקות.
מניחים את העמוד לתוך צינור איסוף חדש 1.5 מיליליטר ולהוסיף 30 עד 50 microliters של מים ללא RNase. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת, לאסוף את הזרימה דרך ולמדוד את ריכוז RNA. כדי להתכונן לתגובת שעתוק הפוכה של 20 מיקרוליטר עושה מיקרוגרם אחד של רנ"א כולל עם 10 מיקרוליטרים של מאגר תגובה, מיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך ומים נטולי RNase.
בצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, על פי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן מערבבים מיקרוליטר אחד של כל דגימת cDNA עם חמישה מיקרוליטרים של התערובת הראשית המכילה צבע סייבר ומיקרוליטר אחד של כל 200 פריימר ספציפי ננו-מולאר. מוסיפים מים לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.
בצע ניתוח PCR, על פי המלצות היצרן. ולאחר מכן השתמש בשיטת CT ההשוואתית כדי לקבוע את הביטוי. בתאי BEAS-2B, הכדאיות לא השתנה במידה ניכרת כאשר התאים טופלו עם 4%CSE במשך שלוש שעות.
שעה אחת כמו זיהום pseudomonas גם לא השפיע באופן משמעותי על הכדאיות. לבסוף, הם משתמשים בג'נטאמיצין כדי להרוג פסאודומונות במדיום התרבותי לא הייתה השפעה מובהקת סטטיסטית על הכדאיות התאית. כפי שנמדד על ידי שיטת צלחת טיפה, זיהום חיידקי בתאי BEAS-2B הוגדל באופן משמעותי על ידי טיפול עם CSE.
כך היה גם לגבי טיפול CSE של HSAEC. זיהום חיידקי של תאי BEAS-2B שטופלו ב- CSE הוערך גם באמצעות RT-PCR לכמת את כמות 16S rRNA הנוכחי, אשר הצביע על עלייה Pseudomonas aeruginosa. תאי BEAS-2B שטופלו ב- CSE ונדבקו ב- Pseudomonas fluorescens Migula נותחו על ידי ציטומטריית זרימה ב 509 ננומטר.
התוצאה גם הצביעה על כך שטיפול CSE מגביר את הזיהום החיידקי. תוצאות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הראו כי חיידקים בעלי תווית GFP היו במשותף עם תאי BEAS-2B בניסוי זיהום פלואורסצנטי פסאודומונס מיגולה. תאים עלולים להיחשף לעשן סיגריות עם רובוטים מעשנים, אשר עשויים לחקות התנהגות אנושית לאפשר לחקור ישירות את ההשפעות של עשן סיגריות על תאי אפיתל ריאות.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור עשן סיגריות על ברזים תא אחרים בהקשר של זיהום ריאתי. הגישה המתוארת להיות הבסיס להתפתחות של טיפולים יעילים נגד סיגריה עישון פגיעה ריאות הגב C0PD נוסף
