Этот протокол использует три подхода, чтобы определить, если сигаретный дым влияет на псевдомонас бактериальной нагрузки в легких эпителиальных клеток. Этот метод может быть расширен до эндотелиальных клеток или других клеточных кранов. Подготовка извлечения сигаретного дыма, бактериальная инфекция и определение с бактериальной нагрузкой хорошо описаны подробно в этом видео.
Эта процедура очень легко следовать для новых пользователей. Нарисуйте 10 миллилитров среды культуры клеток без сыворотки в 60 миллилитров шприца. Прикрепите узкий конец отделки к одному миллилитровому наконечнику пипетки к соплам шприца, как адаптер для удержания сигареты.
Снимите фильтр с сигареты и прикрепите сигарету к адаптеру. Не более чем за 30 минут до выполнения анализа сгорают сигареты и привлечь 40 миллилитров дыма, содержащего воздух в шприц. Смешайте дым со средой, встряхивая шприц энергично.
Повторите процесс рисования, пока сигарета полностью не выгорела, что потребует около 11 ничьих примерно за семь минут. Чтобы удалить микроорганизмы и нерастворимые частицы из среды, процвечение через фильтр 0,22 микрона. Затем перенесите среду в закрытую стерильную трубку.
Прививка триптического соевого бульона или TSB овечьей пластины с выбранным штаммом псевдомонас. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию. Подготовь трубку, содержащую 20 миллилитров TSB с 5%глицеролом в качестве источника углерода.
Соберите мазок из пластины сукера и привить TSB. Инкубировать псевдомонас подвески в 37 градусов по Цельсию шейкер при 200 об /мин, в течение примерно одного часа, пока оптическая плотность на 600 нанометров составляет 0,6. После культивирования легочных эпителиальных клеток, описанных в рукописи, добавьте в клетки один миллилитр 0,25%трипсина.
Примерно через пять минут, когда клетки полностью отделились от нижней части пластины, добавьте 10 миллилитров полной среды высот, чтобы нейтрализовать трипсин. Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку. Затем центрифуга клетки в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 300 раз G.Remove и отказаться от супернатанта.
Затем повторно приостанавливать клетки в миллилитров высот среды с 10%FBS. Pipette 10 микролитров эпителиальной клеточной подвески на новую пластину. Используйте автоматизированный счетчик ячейки для получения концентрации клеток.
Плита легких эпителиальных клеток в концентрации в три раза от 10 до пятой клетки на миллилитр, в общем объеме двух миллилитров среднего на колодец. Инкубировать тарелки на ночь. Когда клетки достигают примерно 80% слияния, заменить средний с высоты среды, плюс 1%FBS.
Затем добавьте 4%CSE к скважинам и инкубировать пластины в течение трех часов. Добавьте псевдомонас к каждому колодец эпителиальных клеток легких, обработанных CSE. Затем инкубировать пластины в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
Затем замените среду в шести пластинах хорошо с двумя миллилитров свежей среды высот, содержащий 4%CSE и 100 микрограмм на миллилитр гентамицина. После инкубации пластин в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию с 5%углеродного диоксида, аспирировать средний из скважин. Вымойте гентамицин обработанных клеток, в два раза, с двумя миллилитров холодного PBS.
Бактерии нагрузки в легких эпителиальных клеток могут быть обнаружены методом капли пластины, qRT-PCR, или поток цитометрии. Добавьте один миллилитр буфера клеточного лиза к каждому колодец эпителиальных клеток легких. Ремонт серийных разбавлений клетки лисад, начиная от одного до 10 до 10000.
Затем привить пластину TSB auger. После 16 часов инкубации определите, сколько единиц колонии было в эпителиальных клетках легких, подсчитав количество бактериальных колоний. Добавьте 0,35 миллилитров буфера тиоцианата гуанидината в каждый колодец эпителиальных клеток легких.
Соберите клетки с помощью клеточного скребка. Пипетка лизать в микро-центрифугу трубки и аккуратно перемешать с пипеткой. Добавьте 0,35 миллилитров свежеприготовленного до 70% этанола к лизате и хорошо перемешайте.
Перенесите все образцы в колонку спина, помещенную в двухми миллилитровую трубку для сбора. Центрифуга коллекционные трубки в течение 30 секунд при 10 000 раз G и от 20 до 25 градусов по Цельсию. Отбросьте буфер в трубке сбора и вымойте колонку 0,7 миллилитров буфера стирки.
Центрифуга колонны в 10 000 раз G в течение 30 секунд. Вымойте столбец дважды с 0,5 миллилитров буфера. Повторите центрифугу при 10 000 раз G в течение двух минут.
Поместите колонку в новую трубку сбора 1,5 миллилитров и добавьте от 30 до 50 микролитров воды без RNase. После центрифугирования трубки в 10 000 раз G в течение одной минуты, собирать поток через и измерить концентрацию РНК. Для подготовки к 20 микролитера обратной реакции транскрипции составляет один микрограмм общей РНК с 10 микролитров буфера реакции, один микролитер обратной транскриптазы и RNase свободной воды.
Провести обратную реакцию транскрипции при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, а затем при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут, в соответствии с протоколом производителя. Затем смешайте один микролитр каждого образца cDNA с пятью микролитров мастер смеси, содержащей кибер красителя и один микролитр каждого 200 наномолярных конкретных грунтовки. Добавьте воду общим объемом 20 микролитров.
Выполните анализ ПЦР, в соответствии с рекомендациями производителя. А затем используйте сравнительный метод КТ для определения выражения. В клетках BEAS-2B жизнеспособность не менялась значительно, когда клетки лечились 4%CSE в течение трех часов.
Один час, как псевдомонас инфекции также существенно не влияет на жизнеспособность. Наконец, они используют гентамицин, чтобы убить псевдомоны в среде культуры не имеют статистически значимого влияния на жизнеспособность клеток. Как измеряется методом капли пластины, бактериальная инфекция в клетках BEAS-2B была существенно увеличена путем лечения CSE.
То же самое относится и к лечению CSE HSAEC. Бактериальная инфекция клеток BEAS-2B, обработанных CSE, также оценивалась с помощью RT-PCR для количественной оценки количества 16S rRNA настоящее время, что указывает на увеличение Pseudomonas aeruginosa. Клетки BEAS-2B, обработанные CSE и инфицированные Pseudomonas fluorescens Migula, были проанализированы цитометрией потока на 509 нанометров.
Результат также показал, что лечение CSE увеличивает бактериальную инфекцию. Результаты флуоресцентной микроскопии показали, что бактерии с маркировкой GFP, локализованные совместно с клетками BEAS-2B в эксперименте по заражению флуоресцентными мигулями Pseudomonas. Клетки могут подвергаться воздействию сигаретного дыма с помощью курящих роботов, которые могут имитировать поведение человека и дать возможность непосредственно изучить влияние сигаретного дыма на эпителиальные клетки легких.
Этот метод может быть использован для изучения сигаретного дыма на других кранах клеток в контексте легочной инфекции. Описанный подход, чтобы быть основой для развития эффективной терапии против курения сигарет спинной травмы легких и C0PD дополнительно
