该协议使用三种方法确定香烟烟雾是否影响肺上皮细胞中的伪多mons细菌负荷。此方法可以扩展到内皮细胞或其他细胞水龙头。本视频详细介绍了香烟烟雾提取、细菌感染和细菌负荷测定的准备情况。
对于新用户来说，此过程很容易遵循。将10毫升无血清细胞培养剂放入60毫升注射器中。将修剪的窄端连接到注射器喷嘴上的一毫升移液器尖端，作为用于握住香烟的适配器。
从香烟上取下过滤器，将香烟连接到适配器上。在进行检测前不超过30分钟，将香烟燃烧，并吸入40毫升含有空气的烟雾进入注射器。通过大力摇动注射器，将烟雾与介质混合。
重复绘图过程，直到香烟完全烧坏，这需要大约 11 次绘制在大约 7 分钟内。要去除介质中的微生物和不溶性颗粒，请通过 0.22 微米过滤器进行过滤。然后，将介质转移到封闭的无菌管中。
用选定的伪多多纳斯菌株接种一个试卵大豆汤或TSB螺旋钻板。在37摄氏度下孵育板。准备一个含有20毫升TSB的管子，以5%甘油作为碳源。
从螺旋板中收集污迹，然后接种TSB。在 200 RPM 的 37 摄氏度摇床中孵育伪单子悬浮液约 1 小时，直到 600 纳米的光学密度为 0.6。培养手稿中描述的肺上皮细胞后，向细胞中加入一毫升0.25%的三辛。
大约五分钟后，当细胞完全脱离板底时，加入10毫升的完整高度介质，以中和三辛。将细胞转移到15毫升管。然后，在摄氏四度和300倍G.下离心5分钟，取出并丢弃上一代。
然后，用10%FBS将细胞重新悬浮成高地介质的毫升。移液10微升的上皮细胞悬浮到一个新的板。使用自动细胞计数器获取细胞浓度。
每毫升以每毫升两毫升的中等浓度将肺上皮细胞以三倍十倍至第五细胞的浓度镀块。一夜之间孵育盘子。当细胞达到约80%汇合时，用"高度"介质替换介质，外加1%FBS。
然后，在井中加入4%CSE，并孵育板3小时。在经过 CSE 治疗的肺上皮细胞的每个井中添加一个伪多体。然后，用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育板一小时。
接下来，用两毫升新鲜高地介质代替六井板中的介质，每毫升根霉素含有 4%CSE 和 100 微克。在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育板一小时后，从井中吸出介质。用两毫升的冷PBS清洗两次经过基因霉素处理的细胞。
然后，可以通过滴板方法、qRT-PCR 或流式细胞仪检测肺上皮细胞中的细菌负荷。在肺上皮细胞的每个井中加入一毫升细胞解液缓冲液。修复细胞的连续稀释，范围从1到10到1到10，000。
然后接种TSB螺旋板。经过16个小时的孵育，通过计算细菌菌落的数量，确定肺上皮细胞中存在多少菌落形成单位。在肺上皮细胞的每个井中加入0.35毫升的硫化盐解液缓冲液。
使用单元格刮刀收集单元格。将落酸移入微离心管中，与移液器轻轻混合。将 0.35 毫升新鲜准备的 70% 乙醇加入到 lysate 中，并混合好。
将所有样品转移到放置在两毫升收集管中的旋转柱上。在10，000倍的G和20至25摄氏度的收集管中离心30秒。丢弃收集管中的缓冲液，用 0.7 毫升洗涤缓冲液清洗柱。
将柱子在10，000倍G下离心30秒。用 0.5 毫升缓冲液清洗柱两次。在 10，000 次 G 下重复离心两分钟。
将柱放入新的 1.5 毫升收集管中，并加入 30 至 50 微升无 RNase 水。在10，000次G下离心管一分钟后，收集流经并测量RNA浓度。为了准备20微升逆转录反应，使1微克的总RNA与10微升的反应缓冲液，一微升的逆转录酶和RNase无水。
根据制造商的协议，在37摄氏度下进行逆转录反应1小时，然后在95摄氏度下进行5分钟。然后将每个 cDNA 样品的一个微升与包含网络染料的主混合物的五微升混合，以及每个 200 纳米摩尔特异性底法的一个微升。加入水，总体积为20微升。
根据制造商的建议执行 PCR 分析。然后使用比较 CT 方法来确定表达式。在 BEAS-2B 细胞中，当细胞用 4%CSE 治疗 3 小时时，生存能力没有显著变化。
一个小时的假多单体感染也没有实质性影响生存能力。最后，他们利用基因霉素在培养基中杀死伪多莫纳斯，对细胞生存能力没有统计学上显著的影响。根据滴板法测量，BEAS-2B细胞的细菌感染通过CSE治疗显著增加。
HSAEC的CSE治疗也是如此。使用RT-PCR对经过采为治疗的 BEAS-2B 细胞的细菌感染进行评估，以量化存在 16S rRNA 的量，这表明伪多多纳斯 aeruginosa 的增加。使用 CSE 治疗并感染伪多荧光米古拉的 BEAS-2B 细胞在 509 纳米流式细胞学分析。
结果表明，CSE治疗会增加细菌感染。荧光显微镜的结果表明，在伪多多纳斯荧光米古拉感染实验中，GFP标记细菌与 BEAS-2B 细胞共同定位于。细胞可能暴露在香烟烟雾与机器人吸烟，这可能模仿人类的行为，并使得可以直接研究香烟烟雾对肺上皮细胞的影响。
在肺感染的背景下，这种技术可以用来探索其他细胞水龙头上的香烟烟雾。所述方法是开发有效疗法的基础，以对抗吸烟后肺损伤和C0PD额外
