Este protocolo usa três abordagens para determinar se a fumaça do cigarro afeta a carga bacteriana pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este método pode ser expandido para células endoteliais ou outras torneiras celulares. A preparação da extração da fumaça do cigarro, a infecção bacteriana e a determinação com uma carga bacteriana são bem descritas em detalhes neste vídeo.
Este procedimento é muito fácil de seguir para os novos usuários. Desenhe 10 mililitros de cultura celular sem soro em uma seringa de 60 mililitros. Conecte a extremidade estreita de uma guarnição a uma ponta de pipeta mililitro no bocal da seringa, como adaptador para segurar o cigarro.
Retire o filtro do cigarro e conecte o cigarro ao adaptador. Não mais do que 30 minutos antes de realizar o ensaio combustão do cigarro e desenhar 40 mililitros de fumaça contendo ar na seringa. Misture a fumaça com o meio sacudindo vigorosamente a seringa.
Repita o processo de desenho até que o cigarro esteja completamente queimado, o que exigirá cerca de 11 empates em aproximadamente sete minutos. Para remover microrganismos e partículas insolúveis do meio, filtre-o através de um filtro de 0,22 míccro. Em seguida, transfira o meio para um tubo estéril fechado.
Inocular um caldo de soja trippático ou placa de auger TSB com uma cepa de pseudomonas selecionada. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Prepare um tubo contendo 20 mililitros de TSB com 5% de glicerol como fonte de carbono.
Recolhe uma mancha da placa de auger e inocula o TSB. Incubar a suspensão pseudomonas em um shaker de 37 graus Celsius a 200 RPM, por aproximadamente uma hora, até que a densidade óptica em 600 nanômetros seja de 0,6. Após a cultura das células epiteliais pulmonares, como descrito no manuscrito, adicione um mililitro de 0,25% de trippsina às células.
Após aproximadamente cinco minutos, quando as células tiverem se separado completamente da parte inferior da placa, adicione 10 mililitros de altura completa para neutralizar a trippsina. Transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar as células por cinco minutos a quatro graus Celsius e 300 vezes G.Remova e descarte o supernasce.
Em seguida, suspenda novamente as células em mililitros de heights médios com 10% de FBS. Pipeta 10 microliters da suspensão da célula epitelial em uma nova placa. Use um contador celular automatizado para obter a concentração celular.
Plaque as células epiteliais pulmonares a uma concentração de três vezes 10 a quinta células por mililitro, em um volume total de dois mililitros de médio por poço. Incubar as placas durante a noite. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, substitua o meio por alturas médias, mais 1%FBS.
Em seguida, adicione 4%CSE aos poços e incuba as placas por três horas. Adicione um pseudomonas a cada poço de células epiteliais pulmonares tratadas com ESE. Em seguida, incubar as placas por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, substitua o meio nas seis placas de poço por dois mililitros de altura fresca, contendo 4% de CSE e 100 microgramas por mililitro de gentamicina. Depois de incubar as placas por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, aspire o meio dos poços. Lave as células tratadas com gentamicina, duas vezes, com dois mililitros de PBS frio.
A carga de bactérias nas células epiteliais pulmonares pode então ser detectada pelo método de placa de gota, qRT-PCR ou citometria de fluxo. Adicione um mililitro de tampão de lise celular a cada poço de células epiteliais pulmonares. Reparar diluições seriais do lise celular, variando de 1 a 10 a 10.000.
Em seguida, inocular a placa de auger TSB. Após 16 horas de incubação, determine quantas unidades formadoras de colônias estavam presentes nas células epiteliais pulmonares, contando o número de colônias bacterianas. Adicione 0,35 mililitros do tampão de tiocianato guanidinium a cada poço de células epiteliais pulmonares.
Colete as células com um raspador de células. Pipete o lise em um tubo de microcrédito e misture suavemente com a pipeta. Adicione 0,35 mililitros de recém-preparado a 70% de etanol ao lise e misture bem.
Transfira todas as amostras para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de dois mililitros. Centrifugar o tubo de coleta por 30 segundos a 10.000 vezes G e 20 a 25 graus Celsius. Descarte o tampão no tubo de coleta e lave a coluna com 0,7 mililitros de tampão de lavagem.
Centrifugar a coluna a 10.000 vezes G por 30 segundos. Lave a coluna duas vezes com 0,5 mililitros de tampão. Repita a centrifugação a 10.000 vezes G por dois minutos.
Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro e adicione 30 a 50 microliters de água sem RNase. Depois de centrifugar o tubo a 10.000 vezes G por um minuto, coletar o fluxo através e medir a concentração de RNA. Preparar-se para uma reação de transcrição reversa de 20 microliteres faz um micrograma de RNA total com 10 microliters de tampão de reação, um microliter de transcriptase reversa e água sem RNase.
Conduza a reação de transcrição reversa a 37 graus Celsius por uma hora e depois a 95 graus Celsius por cinco minutos, de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, misture um microliter de cada amostra de cDNA com cinco microliters da mistura mestre contendo corante cibernético e um microliter de cada 200 primer específico nanomolar. Adicione água para um volume total de 20 microliters.
Realizar a análise de PCR, de acordo com as recomendações do fabricante. E, em seguida, use o método de tomografia comparativa para determinar a expressão. Nas células BEAS-2B, a viabilidade não mudou consideravelmente quando as células foram tratadas com 4% de CSE por três horas.
Uma hora como infecção por pseudomonas também não afetou substancialmente a viabilidade. Finalmente, eles usam a gentamicina para matar pseudomonas no meio da cultura não teve um efeito estatisticamente significativo na viabilidade celular. Medida pelo método da placa de gota, a infecção bacteriana nas células BEAS-2B foi substancialmente aumentada pelo tratamento com ESC.
O mesmo aconteceu com o tratamento de ECS do HSAEC. A infecção bacteriana das células BEAS-2B tratadas com CSE também foi avaliada pelo uso de RT-PCR para quantificar a quantidade de rRNA 16S presente, o que indicou um aumento em Pseudomonas aeruginosa. As células BEAS-2B tratadas com CSE e infectadas com Pseudomonas fluorescens Migula foram analisadas por citometria de fluxo em 509 nanômetros.
O resultado também indicou que o tratamento de ESC aumenta a infecção bacteriana. Os resultados da microscopia fluorescente mostraram que as bactérias rotuladas por GFP co-localizadas com células BEAS-2B em um experimento de infecção por Pseudomonas fluorescens Migula. As células podem ser expostas à fumaça de cigarro com robôs fumando, o que pode imitar o comportamento humano e tornar possível estudar diretamente os efeitos da fumaça do cigarro nas células epiteliais pulmonares.
Esta técnica poderia ser usada para explorar uma fumaça de cigarro em outras torneiras de celular no contexto de uma infecção pulmonar. A abordagem descrita é a base para o desenvolvimento de terapias eficazes contra uma lesão pulmonar dorsal do cigarro e C0PD extra
