שמרים הוא אורגניזם מודל פופולרי, לא רק עבור מחקרים גנטיים, אלא גם עבור מחקרים ביוכימיים של חלבונים מקרומולקולות אחרות שחולצו סוג הבר זני שמרים מוטנטים. עם זאת, בשל קירות התא הקשוחים שלהם, אתגר מרכזי העומד בפני החוקרים הוא תזה יעילה זו של תאי שמרים מבלי לפגוע בתכנים התאיים. הבידוד של מקרומולקולים ביולוגיים שלמים הוא בדרך כלל קריטי, תלוי בטמפרטורה.
הכנת התמציות בטמפרטורה נמוכה מבטיחה כי פרוטאזות תאיים ונוקלאאזים להישאר פעיל, וכתוצאה מכך בידוד אמין של חלבון שלם, חומצות גרעין, מקרומולקולות אחרות עבור תזה מספקת. שיטות שונות זמינות להשגת תמציות שמרים באמצעות תיזה אנזימטית, כימית ופיזית. עם זאת תזה אנזימטית יקרה בשל הדרישה של אנזימים מטוהרים לעכל את קיר התא, ובכך להגביל את השימוש במספר קטן יותר של תאים.
בהמשך יש לעקוב מקרוב אחר התגובות האנזימטיות כדי למנוע עיכול יתר ותוספי תזה מוקדמים של התאים. שיטות כימיות באמצעות סוכני denaturing חזקים, אם כי יעיל, לגרום denaturation של חלבונים וככזה, אינם מתאימים לבידוד של קומפלקסים חלבון או אנזימים פונקציונליים. שיטות פיזיות, כגון תזה תחת לחץ גבוה בעיתונות הצרפתית יכול להתבצע בקור בארבעה צלזיוס אבל זה לא קר מספיק כדי למנוע השפלה ו denaturation של כל החלבונים המקומיים.
שיטות פיזיות פופולריות אחרות הן שימוש במכתש ועלי, בלנדר או מטחנת קפה לטחינת תאי שמרים המתווסכלים במאגר תזה וקפואים כ טיפות או שחיקה ותערובת של חזיות זכוכית ושמרים במפעל מקצף תריס מהיר או תזה על ידי sonication. עם זאת, שחיקה ידנית היא עבודה אינטנסיבית ותפוקת החלבון וכתוצאה מכך יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם לטכניקות המשמשות בעוד תזה על ידי sonication או שחיקה בבלנדר, מטחנת קפה, או טחנת מקצף חרוזים מייצרת כמות משמעותית של חום, וכתוצאה מכך השפלה חלבון השפלה. לכן, כדי להשיג תותבת תאי שמרים עם חלבונים במצבם המקורי עם denaturation מינימלי השפלה עבור יישומים כמו טיהורים של קומפלקסים חלבון פונקציונלי, בדיקות ביוכימיות או זיהוי של שינויים חולפים שלאחר התרגום, חיוני להשתמש בשיטת תותבת מדרגית בקלות כי יהיה למזער את ייצור החום תוך מתן תזה יעילה ללא קשר לכמות התאים.
כאן אנו מתארים שיטה הכוללת שימוש במפעל מקפיא קריו לתזה של תאים בחנקן נוזלי במינוס 196 צלזיוס כדי ליצור תמציות תאים קפואים ובכך לאפשר התאוששות של מקרומולקולות פונקציונליות שלמות, כגון חלבונים או DNA ו- RNA, בטמפרטורות נמוכות מאוד הממזערות השפלה והשפלה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לשימוש עם כל סוג של תא או דגימת רקמה מכל מין, כולל דגימות משפטיות ואפילו עתיקות התאושש מאתרים ארכיאולוגיים או נמצא קפוא. טחנת המקפיא משתמשת בתא שחיקה אלקטרומגנטי מוליכי-על שמזיז במהירות מוט מתכת מוצק קדימה ואחורה בתוך קובץ פוליקרבונט המכיל את הדגימה כדי להימחץ בין תקעי קצה נירוסטה.
שיטת תות תאים פיזית זו מאפשרת תזה יעילה יותר ותוצאות מתרבות בתמצית באיכות טובה יותר. תאי שמרים גדלו בריכוז של 10 מיליון תאים למיליון. תאי שמרים אלה הונחו בקבוק צנטריפוגה מקורר מראש וסובבו במשך 10 דקות ב 2, 400 G.Once הספין הושלם, decant supernatant מבלי להפריע לתאים גלולה.
גלולה זו הייתה resuspended בכמות קטנה של מים קרים קרח, כמחצית הנפח הראשוני של התרבות לשטוף את התאים. התאים המתווסכלים שוב סובבו למטה לעוד 10 דקות ב 2, 400 G. פעם הספין הבא הושלם, אנחנו, שוב, decant כל supernatant מבלי להפריע גלולה. גלולה זו לאחר מכן יהיה resuspended ו 15 ML של חיץ תזה קרה קרח.
ודא כי גלולה הוא resuspended לחלוטין. התאים המתווסכלים צריכים להישאר על קרח בצינור מסומן מראש עד מוכן לשלב הבא. יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי בעת טיפול בחנקן נוזלי, כגון משקפי בטיחות, הגנה על היד ומעילי מעבדה.
כדי למקסם את הקריטריון שלנו, לעתים קרובות אנו לובשים זוג כפפות תרמיות לבנות דחוק בין שני זוגות של כפפות ניטריל. לשנות את הכפפות החיצוניות ניטריל לעתים קרובות, כפי שהם לקרוע בקלות לאחר שנחשף חנקן נוזלי. במעבדה שלנו, אנחנו מעבירים אליקוט של חנקן נוזלי למיכל חנקן נוזלי קטן של חמישה ליטר.
חנקן נוזלי נשפך לאחר מכן לתוך צינור 50 ML כי כבר מקורר מראש על קרח יבש. לאחר צינור 50 ML מלא חנקן נוזלי, אנו מוסיפים את תמצית השמרים לאט, באופן חכם טיפה לצינור במרווחים 1.5 מיליליטר. כדי למזער את היווצרות כדורי פופקורן גדולים, השעיית השמרים מתווספת בתנועה מעגלית.
כדי למנוע עוד יותר היווצרות של כדורי פופקורן גדולים, אנו משתמשים בממטרים גדולים כדי להבטיח את כל כדורי הם בין 0.3 ו 0.5 ס"מ קוטר. בגלל חנקן נוזלי הוא תמיד מתאדה, הקפד מילוי הצינור עם חנקן נוזלי לפני הוספת כל 1.5 מיליון aliquot של השעיית שמרים. לאחר כל השעיית שמרים נעשה פופקורן לאפשר את הצינור עם פופקורן לשבת ללא המכסה במשך שתיים עד שלוש דקות כדי לאפשר לכל חנקן נוזלי שיורית להתאדות.
כדי להיות בטוח כי כל החנקן הנוזלי התאדה, לסגור את המכסה כמעט לחלוטין לנער בעדינות. אם יש רעש של שרוק, זה מצביע על כך שהחנקן הנוזלי עדיין לא התאדה לחלוטין. פתח את המכסה עוד דקה בערך כדי לאפשר לחנקן הנוזלי הנותר להתאדות לפני סגירת המכסה בחוזקה.
שאריות נוזל בצינור עלולות לגרום לפיצוץ אם המכסה סגור בטרם עת. פופקורן שמרים זה יכול להיות מאוחסן כמעט ללא הגבלת זמן מינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות חמש דגימות, להבטיח כי יש לך 30 עד 35 ליטר של חנקן נוזלי זמין. ממלאים את טחנת המקפיא לקו המלא וסגרו את המכסה כדי לאפשר לטחנת המקפיא לצנן מראש במשך כמה דקות.
שוב, זכור תמיד ללבוש ציוד מגן אישי כאשר מתמודדים עם חנקן נוזלי. בקבוקוני שחיקה פוליקרבונט, תקעי קצה נירוסטה, בר המשפיע חייב להיות מקורר מראש עם חנקן נוזלי. שמור רכיבים אלה שקועים עד החנקן הנוזלי מפסיק לבעבע.
זכור לשמור את כל דגימות הפופקורן על קרח יבש עד שכל תהליך הטחינה יושלם. מוציאים את כל החנקן הנוזלי מבקבוקוני הטחינה ומעבירים את הפופקורן לבקבוקון. אל תשכחו למקם בר משפיע מגנטי בבקבוקון השוחקת גם כן.
לאטום את בקבוקון שחיקה על ידי הצבת בזהירות את תקע נירוסטה באופן שווה על קצה הבקבוקון שחיקה. אנחנו דופקים כל קצה של בקבוקון הטחינה על לוח לחם מעץ עם גב גומי סופג רטט כדי להבטיח כי תקעי הקצה ממוקמים כראוי והם איטום בקבוקונים שחיקה בחוזקה. חשוב לאבטח את תקעי הקצה כדי להבטיח שהם לא ישתחררו ויאפשרו לדגימות לשפוך בטחנת המקפיא במהלך תהליך השחיקה.
מניחים בקבוקון שחיקה בתא הטחינה של טחנת המקפיא וננעלים במקום. סוגרים את מכסה טחנת המקפיא וטוחנים את הדגימה במשך שלושה מחזורים בשתי דקות למחזור, בקצב ריסוק של 14. לאחר מחזורי שחיקה הושלמו לפתוח את הבקבוקון עם lysate תא אבקה קפוא.
כדי למנוע את הפשרת ה-lysate, עבוד במהירות ובזהירות כדי לפתוח את אחד התקעים הסופית באמצעות כלי הפתיחה. לאחר הבקבוקון פתוח, להסיר את בר המשפיע ולהעביר במהירות את תמצית אבקה קפואה על צלחת שקילה פלסטיק מקורר מראש. לשחזר כמה שיותר של תמצית קפואה ככל האפשר על ידי דפיקות הבקבוקון על לוח הלחם מעץ.
לאחר הסרת כל האבקה מהבקבוקון, מעבירים במהירות את כל תמציות האבקה לצינור 15 מ"מ המסוקרן מראש על קרח יבש. למרות שעדיף להמשיך עם הפשרה ושימוש תמציות מיד כדי למזער את השפלת החלבון, ליזאת אבקה קפואה ניתן לאחסן לילה במינוס 80, במידת הצורך. להפשיר את האבקה lysate לאט תרחיף קרח כי הוא מופץ ברציפות באמצעות בר ערבוב מגנטי בדלי קרח.
כדי להקל אפילו הפשרה, להסיר קרח המתפתח בצד החיצוני של הצינורות לעתים קרובות, על כל חמש דקות בערך. ברגע שהתמציות מתחילות להפשיר בקוקטייל מעכב פרוטאז 1X ו-10 מעכבי פרוטאזום מיקרומולריים MG132 למניעת השפלת חלבונים. לאחר הדגימות מופשרות לחלוטין, אשר יכול לקחת יותר משעה, לסובב את הדגימות ב 3, 220 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ספין זה יסיר את רוב פסולת התא מהליסאט. כאשר הספין הוא להשלים להעביר את supernatant לתוך בקבוקי פוליקרבונט כי כבר צונן מראש על הקרח להשליך את גלולה. צנטריפוגה supernate ודגימות ב 16, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להבהיר את התמצית.
לאחר השלמת הספין, לשחזר רק את supernatant ברור בזהירות מאמצע העמודה הנוזלית מבלי להפריע לשכבה מעוננת המכילה את החתיכה על גבי או את הפסולת גלולה בתחתית הצינור צנטריפוגה. מעבירים את הלט הברור לצינור 15 מ"ל צונן מראש. הנוזל המעונן הנותר יכול להיות לאחרונה במשך חמש דקות באותה מהירות כדי לאפשר התאוששות של כמה יותר של lysate הסיטונאי.
התמציות מוכנות כעת לשימוש בניסויים, כגון טיהור קומפלקסים של חלבונים ו immunoprecipitation. השווינו שתי שיטות שונות של ת ליסיס תאי שמרים, כלומר כרסום חרוזי זכוכית בארבעה צלזיוס ושיטת שחיקת קריו אוטומטית במינוס 196 צלזיוס כדי להעריך את החלבונים ותמציות התאים התאוששו יחסית שהוכנו בשתי השיטות. ממחקר זה בחרנו להשתמש זן שמרים ניצנים נושאת פלסמיד עותק גבוה להביע טנדם HIS-MYC מתויג בכל מקום.
אז אנחנו יכולים להעריך את הזיקה של התאוששות של חלבונים מתויגים polyubiquitinated מתמציות סיטונאיות, בעקבות טיהור זיקה באמצעות טאלון קובלט שלו תג זיקה חרוזים ואחריו כתמים מערביים עם נוגדן תג HIS חד שבטי. חלבונים Polyubiquitinated כי הם בדרך כלל קצרי מועד מאוד בשל השפלה מהירה שלהם על ידי מכונות פרוטאיוזום בכל מקום ובכך מציעים דרך טובה מאוד להשוות את האיכות של תמציות סיטונאיות שהוכנו בשיטות שונות. כפי שאנו רואים על ידי החצי הימני של קרום מוכתם Ponceau, מצאנו תפוקת חלבון הכולל גבוה יותר בתמציות הסיטונאי שהוכן על ידי פרוטוקול טחנת מקפיא cryo כפי שנשפט על ידי כתמים אינטנסיביים יותר Ponceau לאורך נתיב התמצית הסיטונאי.
זה ברור במיוחד בחלקים התחתונים והחלקים העליונים של טחנת המקפיא כל תמציות נתיבים. בנוסף, כפי שמוצג על ידי החצי הימני של כתם המערבי תג HIS, ראינו התאוששות טובה יותר של חלבון בכל מקום HIS-MYC ואחריו למשוך למטה באמצעות חזיות טאלון מן התמציות הסיטונאי שהוכנו על ידי שחיקה קריוגנית. אנו מסיקים כי טחנת המקפיא קריוגניים עדיף על שיטות אחרות להכנת תמציות תאים, במיוחד כאשר macromolecules פונקציונלי נדרשים עבור יישום במורד הזרם.
