Maya popüler model organizma, sadece genetik çalışmalar için değil, aynı zamanda yabani tip ve mutant maya suşları çıkarılan proteinler ve diğer makromoleküllerin biyokimyasal çalışmalar için. Ancak, onların sert hücre duvarları nedeniyle, araştırmacıların karşı karşıya olduğu önemli bir sorun hücresel içeriğe zarar vermeden maya hücrelerinin bu verimli lysis olduğunu. Bozulmamış biyolojik makromoleküllerin izolasyonu genellikle sıcaklığa bağlı olarak önemlidir.
Ekstrelerin düşük sıcaklıkta hazırlanması, hücre içi proteazların ve nükleazların inaktif kalmasını sağlar ve bu da bozulmamış proteinin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin yeterli derecede izole edilmesine neden olabilir. Enzimatik, kimyasal ve fiziksel olarak maya özleri elde etmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Ancak enzimatik lysis hücre duvarı sindirmek için saflaştırılmış enzimlerin gereksinimi nedeniyle pahalı, böylece hücrelerin daha az sayıda kullanımını sınırlayan.
Daha fazla enzimatik reaksiyonlar sindirim ve hücrelerin erken lysis önlemek için yakından izlenmelidir. Güçlü denatüre ajanlar kullanarak kimyasal yöntemler, etkili olsa da, proteinlerin denatürasyonu neden ve bu nedenle, protein kompleksleri veya fonksiyonel enzimlerin izolasyon için uygun değildir. Bir Fransız basınında yüksek basınç altında lysis gibi fiziksel yöntemler, dört santigrat soğukta yapılabilir ama tüm yerli proteinlerin bozulmasını ve denatürasyon önlemek için yeterince soğuk değildir.
Diğer popüler fiziksel yöntemler bir harç ve havaneli, blender veya kahve öğütücü kullanımı bir lysis tampon resuspended maya hücreleri öğütmek ve damlacıkveya taşlama ve cam boncuk ve maya karışımı olarak dondurulmuş hızlı bir hazırlık boncuk çırpıcı değirmen veya sonication tarafından bir lysis. Ancak, manuel taşlama emek yoğun dur ve elde edilen protein verimi bir blender, kahve öğütücü veya boncuk çırpıcı değirmeninde sonication veya taşlama ile lysis sırasında kullanılan tekniklere bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir, hangi bir protein denatürasyon ve bozulma ile sonuçlanır ısı önemli miktarda üretir. Bu nedenle, fonksiyonel protein komplekslerinin saflaştırılması, biyokimyasal tahliller veya geçici post-translations tespiti gibi uygulamalar için en az denatürasyon ve bozulma ile kendi doğal durumunda proteinler ile maya hücre lisis elde etmek için, hücrelerin miktarı ne olursa olsun verimli lysis sağlarken ısı üretimini en aza indirecek bir kolay ölçeklenebilir lysis yöntemi kullanmak esastır.
Burada eksi 196 Santigrat derecelik sıvı nitrojendeki hücrelerin lysis'i için bir kriyo dondurucu değirmeninin kullanılmasını içeren bir yöntemi açıklayarak dondurulmuş hücre ekstreleri üreterek proteinler, DNA ve RNA gibi bozulmamış fonksiyonel makromoleküllerin, denatürasyon ve bozulmayı en aza indiren çok düşük sıcaklıklarda geri kazanılmasına olanak sağlıyoruz. Bu yöntem, arkeolojik alanlardan çıkarılan veya donmuş donmuş halde bulunan adli ve hatta antik örnekler de dahil olmak üzere herhangi bir türden herhangi bir türden alınan her türlü hücre veya doku örneğinde kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Dondurucu değirmeni, paslanmaz çelik uç fişler arasında toz haline getirilecek numuneyi içeren bir polikarbonat dosyası içinde katı metal çubuğu hızla ileri geri hareket ettiren süper iletken bir elektromanyetik taşlama haznesi kullanır.
Bu fiziksel hücre lisis yöntemi daha verimli bir lysis sağlar ve tekrarlanabilir daha kaliteli bir özü sonuçlanır. Maya hücreleri mil başına 10 milyon hücre konsantrasyonu ile yetiştirildi. Bu maya hücreleri önceden soğutulmuş santrifüj şişesi yerleştirildi ve 2, 400 G.'de 10 dakika döndürüldü.
Bu pelet küçük bir miktar buzlu suda yeniden asılı ydı, hücreleri yıkamak için kültürün ilk hacminin yaklaşık yarısı. Yeniden askıya alınan hücreler 2, 400 G.'de 10 dakika daha eğildi. Bu pelet daha sonra yeniden askıya alınacak ve 15 ML buz soğuk lysis tampon.
Peletin tamamen askıya alındığını sağlayın. Yeniden askıya alınan hücreler, bir sonraki adıma hazır olana kadar önceden işaretlenmiş bir tüpte buz üzerinde kalmalıdır. Güvenlik gözlükleri, el koruması ve laboratuvar önlüğü gibi sıvı nitrojeni kullanırken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyin.
El becerimizi en üst düzeye çıkarmak için, genellikle iki çift nitril eldiven arasına sıkışmış bir çift beyaz termal eldiven giyeriz. Sıvı nitrojene maruz kaldıktan sonra kolayca yırtıldığı için dış ve nitril eldivenleri sık sık değiştirin. Laboratuarımızda, küçük bir beş litrelik sıvı azot kabına sıvı nitrojen bir aliquot aktarıyoruz.
Sıvı nitrojen daha sonra kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş olan 50 ML tüp içine dökülür. Bir kez 50 ML tüp sıvı azot dolu, biz yavaş yavaş maya ekstresi ekleyin, 1.5 mililitre likit artışlarla tüp bir damla akıllıca bir şekilde. Büyük patlamış mısır pelet oluşumunu en aza indirmek için, maya süspansiyon dairesel bir hareket le eklenir.
Büyük patlamış mısır peletlerinin oluşumunu daha fazla önlemek için, tüm peletlerin çapı0,3 ile 0,5 santimetre arasında olduğundan emin olmak için büyük bütüller kullanırız. Sıvı nitrojen her zaman buharlaştığından, her 1,5 mil maya süspansiyon eklemeden önce tüpü sıvı nitrojenle doldurduktan emin olun. Maya süspansiyon tüm patlamış mısır haline getirilmiştir sonra patlamış mısır ile tüp iki ila üç dakika boyunca kapağı olmadan oturup tüm artık sıvı azot buharlaşmasına izin sağlar.
Sıvı nitrojenin buharlaştığından emin olmak için kapağı neredeyse tamamen kapatın ve hafifçe titretin. Eğer bir tıslama sesi varsa, bu sıvı nitrojenin henüz tam olarak buharlaşmadığını gösterir. Kapağı sıkıca kapatmadan önce kalan sıvı nitrojenin buharlaşmasını sağlamak için kapağı bir dakika kadar daha açın.
Kapak erken kapatılırsa tüpteki artık sıvı patlamaya neden olabilir. Bu maya patlamış mısır eksi 80 derece C.For en az beş örnek için, sıvı azot mevcut 30 ila 35 litre olduğundan emin olmak için neredeyse süresiz olarak saklanabilir. Dondurucu değirmenini tam çizgiye doldurun ve kapağı kapatın ve dondurucu değirmeninin birkaç dakika soğumasını bekleyin.
Yine, her zaman sıvı nitrojen ile uğraşırken kişisel koruyucu giysiler giymeyi unutmayın. Polikarbonat taşlama şişeleri, paslanmaz çelik uç fişler ve darbe çubuğu sıvı nitrojen ile önceden soğutulmalıdır. Sıvı nitrojen köpürmeyi durdurana kadar bu bileşenleri batık tutun.
Tüm öğütme işlemi tamamlanana kadar kuru buz üzerinde tüm patlamış mısır örnekleri tutmak için unutmayın. Öğütme şişelerinden tüm sıvı nitrojeni çıkar ve patlamış mısırınızı şişeye aktar. Öğütme şişesine de manyetik bir darbe çubuğu yerleştirmeyi unutmayın.
Taşlama şişesinin ucuna paslanmaz çelik fişi dikkatlice eşit olarak yerleştirerek taşlama şişesini kapatın. Biz son fişler doğru yerleştirilir ve sıkıca taşlama şişeleri mühürleme sağlamak için bir titreşim emici kauçuk destek ile ahşap bir ekmek tahtası üzerinde taşlama şişe her ucunu bang. Bu gevşek gelmez ve taşlama işlemi sırasında dondurucu değirmende dökülmesine izin vermek için son fişleri güvenli önemlidir.
Dondurucu değirmen taşlama odasına bir taşlama şişe yerleştirin ve yerine kilitleyin. Dondurucu değirmen kapağını kapatın ve numuneyi 14 kırma hızında, döngü başına iki dakika boyunca üç döngü boyunca öğütün. Taşlama döngüleri tamamlandıktan sonra dondurulmuş toz hücre lisat ile şişe kilidini.
Lysate'nin erimesini önlemek için, açma aletini kullanarak uç fişlerden birini sökmek için hızlı ve dikkatli çalışın. Şişe açıldıktan sonra, impactor çubuğunu çıkarın ve dondurulmuş toz ekstresini önceden soğutulmuş plastik tartım kabına hızlı bir şekilde aktarın. Ahşap ekmek tahtası üzerinde şişe vurarak mümkün olduğunca dondurulmuş özü kadar kurtarmak.
Tüm toz şişeden çıkarıldıktan sonra, toz ekstrelerinin tamamını kuru buzüzerinde tutulan önceden etiketlenmiş 15 mil tüpe hızlıca aktarın. Protein bozulmasını en aza indirmek için özleri hemen kullanarak erimeye devam etmek en iyisi olsa da, gerekirse dondurulmuş toz lysate bir gecede eksi 80'de saklanabilir. Sürekli bir buz kovası bir manyetik karıştırma çubuğu kullanarak dolaşan bir buz bulamaç yavaş yavaş toz lysate dışarı çözülür.
Hatta erime kolaylaştırmak için, tüplerin dışında sık sık gelişir buz kaldırmak, yaklaşık her beş dakikada bir ya da öylesine. Bir kez özler 1X proteaz inhibitör kokteyl ve 10 mikromolar proteozom inhibitörü MG132 protein bozulmasını önlemek için çözülmeye başlar. Numuneler tamamen çözüldükten sonra, bir saatten fazla sürebilir, 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca 3, 220 G'de numuneleri aşağı doğru döndürün.
Bu dönüş, hücre enkazının çoğunu lysate'den temizler. Spin tamamlandığında supernatant önceden buz üzerinde soğutulmuş olan polikarbonat şişeler içine aktarım ve pelet atın. Ekstresi netleştirmek için 16, 000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca süpernate ve örnekleri santrifüj edin.
Dönüş tamamlandıktan sonra, üstündeki parçayı veya santrifüj tüpünün altındaki peletli enkazı içeren bulutlu katmanı rahatsız etmeden sıvı sütunun ortasından sadece berrak süpernatant'ı dikkatlice kurtarın. Temiz lysate taze önceden soğutulmuş 15 Mil tüp içine aktarın. Kalan bulutlu sıvı, toptan olarak biraz daha geri kazanımı sağlamak için aynı hızda beş dakika süreyle son zamanlarda eritilebilir.
Özler artık protein komplekslerinin saflaştırılması ve immünopresipitasyon gibi deneylerde kullanıma hazırdır. Her iki yöntemle hazırlanan göreceli olarak kurtarılan proteinleri ve hücre özlerini değerlendirmek için maya hücresi lysis'in iki farklı yöntemini karşılaştırdık: dört santigrat derecede cam boncuk frezeleme ve eksi 196 Santigrat derecede otomatik kriyo öğütme yöntemi. Bu çalışmadan biz bir tandem HIS-MYC etiketli ubiquitin ifade yüksek bir kopya plazmid taşıyan bir tomurcuklanan maya suşu kullanmayı seçti.
Bu yüzden talon kobalt HIS etiket afinite boncuklar kullanarak yakınlık saflaştırma aşağıdaki, toptan özler etiketli poliubiquitinated proteinlerin kurtarma yakınlık değerlendirebilirsiniz bir monoklonal HIS tag antikor ile Batı blotting takip. Normalde çok kısa ömürlü olan poliubiquitinated proteinler her yerde proteozom makine ile hızlı bozulması nedeniyle ve böylece farklı yöntemlerle hazırlanan toptan özler kalitesini karşılaştırmak için çok iyi bir yol sunuyoruz. Ponceau lekeli membransağ yarısında gördüğümüz gibi, biz toptan özü şerit boyunca daha yoğun Ponceau boyama tarafından değerlendirilen kriyo dondurucu değirmen protokolü tarafından hazırlanan toptan özler daha yüksek bir toplam protein verimi kurtarıldı.
Bu özellikle dondurucu değirmenbütün özler şeritlerin alt ve üst kısımlarında açıktır. Ayrıca, HIS etiketi Batı leke sağ yarısında gösterildiği gibi, biz kriyojenik taşlama tarafından hazırlanan toptan özleri Talon boncukkullanarak aşağı çekmek ardından HIS-MYC etiketi ubiquitinated protein daha iyi bir iyileşme gözlendi. Kriyojenik dondurucu değirmeninin hücre ekstrelerinin hazırlanmasında diğer yöntemlerden daha üstün olduğu sonucuna vardık, özellikle de aşağı akım uygulaması için fonksiyonel makromoleküller gerekli olduğunda.
