酵母是流行的模型生物体，不仅用于基因研究，而且用于从野生类型和突变酵母菌株中提取的蛋白质和其他大分子的生化研究。然而，由于它们坚固的细胞壁，研究人员面临的一个主要挑战是酵母细胞的这种高效解解，而不会损害细胞的含量。分离完整的生物大分子通常是关键的，取决于温度。
在低温下制备提取物可确保细胞内蛋白酶和核酸酶保持非活动状态，从而可靠地分离完整的蛋白质、核酸和其他大分子，以进行足够的分解。各种方法可用于通过酶、化学和物理溶解获得酵母提取物。然而，酶解是昂贵的，因为纯化酶需要消化细胞壁，从而限制了使用较少数量的细胞。
此外，酶反应必须密切监测，以防止过度消化和细胞过早分裂。使用强变性剂的化学方法虽然有效，但会导致蛋白质变性，因此不适合分离蛋白质复合物或功能酶。物理方法，如在法国出版社的高压下分解，可以在4摄氏度的寒冷中进行，但是这种方法不够冷，无法防止所有原生蛋白质的降解和变性。
其他流行的物理方法是使用砂浆和害虫，搅拌机，或咖啡研磨机研磨酵母细胞重新悬浮在一个溶解缓冲液和冻结作为液滴或研磨和玻璃珠和酵母的混合物在快速准备珠搅拌机磨机或通过声波解合。然而，手动研磨是劳动密集型的，由此产生的蛋白质产量可能因采用的技术而有很大差异，而通过声波化或研磨在搅拌机、咖啡研磨机或珠磨机中产生大量热量，从而产生蛋白质变性和降解。因此，为了获得酵母细胞解解与蛋白质在原生状态，以最小的变性和降解应用，如功能蛋白复合物的纯化，生化测定或检测转瞬即逝的翻译后修饰，这是必要的使用易于伸缩的解解方法，将最小的热量生成，同时允许有效的解解，无论细胞的数量。
在这里，我们描述了一种方法，它涉及使用低温冷冻机在零下196摄氏度的液氮中分解细胞，从而产生冷冻细胞提取物，从而允许在非常低的温度下恢复完整的功能大分子，如蛋白质或DNA和RNA，从而最大限度地减少变性和降解。这种方法可以很容易地适应使用任何类型的细胞或组织样本从任何物种，包括法医，甚至古代样本从考古遗址恢复或发现冻结在永久冻土。冷冻机使用超导电磁磨床，在含有样品的聚碳酸酯文件中快速来回移动固体金属棒，在不锈钢端塞之间粉碎。
这种物理细胞解解方法允许更高效的解解，并可重复地产生更高质量的提取物。酵母细胞以每密耳1000万细胞的浓度生长。这些酵母细胞被放置在冷却前的离心瓶中，并在2，400G下旋转10分钟。
这种颗粒被重新在少量的冰冷水中重新暂停，大约一半的初始培养量来清洗细胞。重新暂停的细胞在2，400G下再次旋转10分钟。然后，该颗粒将重新暂停和15ML的冰冷解液缓冲液。
确保颗粒完全重新暂停。重新暂停的细胞应保留在冰面上，在预先标记的管子中，直到为下一步做好准备。处理液氮时，请始终佩戴个人防护设备，如安全眼镜、手部防护服和实验室外套。
为了最大限度地提高我们的灵巧性，我们经常戴一双夹在两双硝酸盐手套之间的白色热手套。经常更换外侧和硝酸盐手套，因为它们在接触液氮后容易撕裂。在我们的实验室中，我们将一个液氮的等分转移到一个五升的液氮容器中。
然后将液氮倒入 50 ML 管中，该管在干冰上预冷却。一旦50ML管充满液氮，我们慢慢添加酵母提取物，以1.5毫升的增量以明智的方式滴到管中。为了尽量减少大爆米花颗粒的形成，酵母悬浮液被加入圆周运动。
为了进一步防止形成大型爆米花颗粒，我们使用大钳子确保所有颗粒的直径在 0.3 到 0.5 厘米之间。由于液氮总是蒸发，在添加每1.5密耳的酵母悬浮液之前，一定要用液氮重新填充管子。一旦所有的酵母悬浮液都制成爆米花，让带爆米花的管子在没有盖子的情况下坐两到三分钟，让所有残留的液氮蒸发。
要确保所有液氮都蒸发了，请几乎完全合上盖子并轻轻摇动。如果发出发出发出发出发出发出的声音，则表示液氮尚未完全蒸发。在紧闭盖子之前，请再打开盖子一分钟左右，让剩余的液氮蒸发。
如果盖子过早关闭，管中的残余液体可能会导致爆炸。这种酵母爆米花几乎可以无限期地储存在零下80摄氏度。对于至少5个样品，确保您有30至35升的液氮可用。将冷冻机填充到整条生产线上，并合上盖子，使冷冻机预冷却几分钟。
同样，在处理液氮时，始终记得佩戴个人防护装备。聚碳酸酯研磨瓶、不锈钢端塞和冲击杆必须用液氮预冷却。保持这些成分淹没，直到液氮停止冒泡。
请记住，将所有爆米花样品放在干冰上，直到整个研磨过程完成。从研磨瓶中拉出所有液氮，将爆米花转移到小瓶中。不要忘记在研磨瓶中放置磁性冲击棒。
通过小心地将不锈钢塞塞均匀地放在研磨小瓶的端端，密封研磨瓶。我们用振动吸收橡胶背衬将研磨小瓶的每一端敲在木面包板上，以确保端塞正确放置并紧紧密封研磨小瓶。固定端塞非常重要，以确保它们不会松动，并允许样品在磨削过程中溢出到冷冻机中。
将研磨瓶放在冷冻磨机磨削室中，并锁定到位。关闭冷冻机盖，每循环两分钟，以 14 的破碎率研磨样品三圈。磨削循环完成后，使用冷冻粉末细胞糖酸盐解锁小瓶。
为防止落酸解冻，请快速小心地使用开口工具拧开其中一个端塞。小瓶打开后，拆下冲击杆，快速将冷冻粉末提取物转移到预冷冻塑料称重盘上。通过敲打木面包板上的小瓶，尽可能多地回收冷冻提取物。
一旦所有粉末从小瓶中去除，快速将所有粉末提取物转移到干冰上预标记的 15 mil 管中。虽然最好立即进行解冻和使用提取物，以尽量减少蛋白质降解，但如果需要，冷冻粉末解酶可以过夜地储存在零下80度。将粉末在冰浆中缓慢解冻，冰浆使用冰桶中的磁搅拌棒连续循环。
为了方便甚至解冻，去除经常在管子外面发育的冰，大约每五分钟左右一次。一旦提取物开始解冻1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒和10微摩尔蛋白酶体抑制剂MG132，以防止蛋白质降解。样品完全解冻后，可能需要一个多小时，在3，220G下旋转样品，在4摄氏度下旋转20分钟。
这种旋转将去除裂酸中大部分细胞碎片。当旋转完成时，将上先液转移到在冰上预冷却的聚碳酸酯瓶中，然后丢弃颗粒。将超生和样品在摄氏4度下在16，000G下离心20分钟，以澄清提取物。
旋转完成后，仅从液体柱中间小心地回收透明上清液，而不会干扰顶部包含该部件的云层或离心管底部的颗粒碎屑。将透明酸盐转移到新鲜预冷却的 15 Mil 管中。剩余的多云液体可以以相同的速度近五分钟，以便回收更多的批发酸盐。
这些提取物现在准备用于实验，如蛋白质复合物的纯化和免疫沉淀。我们比较了酵母细胞解解的两种不同方法，即在四摄氏度时磨玻璃珠和在零下196摄氏度的自动低温研磨方法，以评估用这两种方法准备的相对回收的蛋白质和细胞提取物。从这项研究中，我们选择使用一种萌芽酵母菌株，携带高拷贝质粒，表达串联的 HIS-MYC 标记泛素。
因此，我们可以评估从批发提取物中回收标记多泛蛋白的亲和力，使用TALON钴 HIS标记亲和力珠进行亲和力纯化，然后用单克隆SS标签抗体进行西方印迹。多泛素蛋白通常非常短寿命，由于泛素蛋白酶体机械的快速降解，因此提供了一个很好的方法来比较用不同方法准备的批发提取物的质量。正如我们在庞塞奥染色膜的右半部分看到的，我们在低温冷冻机协议准备的批发提取物中回收了较高的总蛋白质产量，这是根据整个批发提取物通道中更密集的庞塞奥染色来判断的。
这在冷冻机整体萃取通道的下部和上部尤为明显。此外，如 HIS 标签西方印迹的右半部分所示，我们观察到 HIS-MYC 标记泛素蛋白的更好恢复，然后使用塔隆珠从低温研磨准备的批发提取物中向下拉。我们的结论是，低温冷冻机优于其他制备细胞提取物的方法，特别是当下游应用需要功能大分子时。
