Il lievito è un organismo modello popolare, non solo per studi genetici ma anche per studi biochimici di proteine e altre macromolecole estratte da ceppi di lievito selvatico e mutante. Tuttavia, a causa delle loro pareti cellulari dure, una sfida importante che i ricercatori devono affrontare è questa analisi efficiente delle cellule di lievito senza danneggiare il contenuto cellulare. L'isolamento delle macromolecole biologiche intatte è solitamente critico, dipendente dalla temperatura.
La preparazione degli estratti a bassa temperatura garantisce che le proteasi intracellulari e le nucleasi rimangano inattive, con conseguente isolamento affidabile di proteine intatte, acidi nucleici e altre macromolecole per una lysis sufficiente. Sono disponibili vari metodi per ottenere estratti di lievito attraverso llisi enzimatica, chimica e fisica. Tuttavia la lisi enzimatica è costosa a causa del requisito degli enzimi purificati per digerire la parete cellulare, limitando così l'uso di un numero minore di cellule.
Inoltre, le reazioni enzimatiche devono essere monitorate attentamente per prevenire la digestione e lalisi prematura delle cellule. I metodi chimici che utilizzano forti agenti denaturanti, sebbene efficaci, si traducono nella denaturazione delle proteine e, come tali, non sono adatti per l'isolamento di complessi proteici o enzimi funzionali. I metodi fisici, come lalisi sotto alta pressione in una stampa francese possono essere eseguiti al freddo a quattro Gradi Celsius, ma ciò non è abbastanza freddo da prevenire la degradazione e la denaturazione di tutte le proteine autoctone.
Altri metodi fisici popolari sono l'uso di malta e pestello, frullatore o macinino da caffè per macinare le cellule di lievito risosopendato in un tampone di lisi e congelato come goccioline o macinazione e miscela di perline di vetro e lievito in un mulino beater di perline di preparazione veloce o una lisi per sonicazione. Tuttavia, la macinazione manuale è ad alta intensità di manodopera e la resa proteica risultante può variare considerevolmente a seconda delle tecniche utilizzate durante la sonicazione o la macinazione in un frullatore, macinino da caffè o mulino perline genera una notevole quantità di calore, che si traduce in una denaturazione e degradazione proteica. Pertanto, per ottenere lisi cellulare del lievito con proteine allo stato nativo con denaturazione e degradazione minime per applicazioni come purificazione di complessi proteici funzionali, saggi biochimici o rilevamento di fugaci modifiche post-traslazionali, è essenziale utilizzare un metodo di lisi facilmente scalabile che riduca al minimo la generazione di calore consentendo al contempo una lisi efficiente indipendentemente dalla quantità di cellule.
Qui descriviamo un metodo che prevede l'uso di un mulino crio congelatore per la lisi delle cellule in azoto liquido a meno 196 Celsius per generare estratti di cellule congelate consentendo così il recupero di macromolecole funzionali intatte, come proteine o DNA e RNA, a temperature molto basse che riducono al minimo la denaturazione e la degradazione. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'uso con qualsiasi tipo di campione cellulare o tissutale di qualsiasi specie, compresi campioni forensi e persino antichi recuperati da siti archeologici o trovati congelati nel permafrost. Il congelatore utilizza una camera di rettifica elettromagnetica superconduttiva che sposta rapidamente una barra metallica solida avanti e indietro all'interno di un file in policarbonato contenente il campione da polverizzare tra tappi di estremità in acciaio inossidabile.
Questo metodo dilisi cellulare fisica consente unalisi più efficiente e si traduce in modo riproducibile in un estratto di migliore qualità. Le cellule di lievito sono state coltivate ad una concentrazione di 10 milioni di cellule per milione. Queste cellule di lievito sono state poste in bottiglia di centrifuga pre refrigerata e sono state filate per 10 minuti a 2.400 G.Una volta completato lo spin, decantare il supernatante senza disturbare le cellule pellettate.
Questo pellet è stato rimorsinato in una piccola quantità di acqua ghiacciata, circa la metà del volume iniziale della coltura per lavare le cellule. Le cellule rimescolate sono state nuovamente girate verso il basso per altri 10 minuti a 2.400 G.Una volta completato il prossimo giro, abbiamo, ancora una volta, decantato tutto il supernatante senza disturbare il pellet. Questo pellet verrà quindi rimescolato e 15 ML di tampone di lisi ghiacciata.
Assicurarsi che il pellet sia completamente rimorsinato. Le cellule rimorsinite devono rimanere sul ghiaccio in un tubo pre-marcato fino a quando non sono pronte per il passaggio successivo. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dell'azoto liquido, come occhiali di sicurezza, protezione delle mani e cappotti da laboratorio.
Per massimizzare la nostra destrezza, spesso indossiamo un paio di guanti termici bianchi incastrato tra due paia di guanti di nitrile. Cambiare frequentemente i guanti esterni e nitrili, poiché si strappano facilmente dopo essere stati esposti all'azoto liquido. Nel nostro laboratorio trasferiamo un'aliquota di azoto liquido in un piccolo contenitore di azoto liquido da cinque litri.
L'azoto liquido viene quindi versato in un tubo da 50 ML che è stato preri refrigerato su ghiaccio secco. Una volta che il tubo da 50 ML è pieno di azoto liquido, aggiungiamo lentamente l'estratto di lievito, in modo saggio al tubo con incrementi di 1,5 millilitri. Per ridurre al minimo la formazione di grandi pellet di popcorn, la sospensione del lievito viene aggiunta in un movimento circolare.
Per prevenire ulteriormente la formazione di grandi pellet di popcorn, utilizziamo grandi forcep per garantire che tutti i pellet siano tra 0,3 e 0,5 centimetri di diametro. Poiché l'azoto liquido evapora sempre, assicurarsi di riempire il tubo con azoto liquido prima di aggiungere ogni 1,5 milioni di aliquota di sospensione del lievito. Una volta che tutta la sospensione del lievito è stata trasformata in popcorn, lasciare che il tubo con popcorn si sieda senza coperchio per due o tre minuti per lasciare evaporare tutto l'azoto liquido residuo.
Per essere sicuri che tutto l'azoto liquido sia evaporato, chiudere il coperchio quasi completamente e agitare delicatamente. Se c'è un rumore sibiliante, indica che l'azoto liquido non è ancora completamente evaporato. Aprire il coperchio per un altro minuto circa per consentire all'azoto liquido rimanente di evaporare prima di chiudere saldamente il coperchio.
Il liquido residuo nel tubo può causare un'esplosione se il coperchio viene chiuso prematuramente. Questo popcorn di lievito può essere conservato quasi indefinitamente in meno 80 gradi C.Per almeno cinque campioni, assicurarsi di avere a disposizione da 30 a 35 litri di azoto liquido. Riempire il congelatore fino alla linea completa e chiudere il coperchio per consentire al frantoio di prerire raffreddare per alcuni minuti.
Ancora una volta, ricorda sempre di indossare dispositivi di protezione individuale quando hai a che fare con azoto liquido. I flaconcini di rettifica in policarbonato, i tappi di estremità in acciaio inossidabile e la barra del riflettore devono essere prerimor freddi con azoto liquido. Mantenere questi componenti sommersi fino a quando l'azoto liquido smette di gorgogliare.
Ricordarsi di conservare tutti i campioni di popcorn sul ghiaccio secco fino al completamento dell'intero processo di macinazione. Estrarre tutto l'azoto liquido dalle fiale di macinazione e trasferire i popcorn nel flaconcino. Non dimenticare di posizionare anche una barra del dispositivo di impatto magnetico nella fiala di rettifica.
Sigillare il flaconcino di rettifica posizionando con cura il tappo in acciaio inossidabile uniformemente all'estremità del flaconcino di rettifica. Sbattiamo ogni estremità del flaconcino di macinazione su un breadboard di legno con un supporto in gomma che assorbe le vibrazioni per garantire che i tappi finali siano posizionati correttamente e sigillino saldamente i flaconcini di rettifica. È importante fissare le spine finali per assicurarsi che non si allentlino e consentano ai campioni di riversarsi nel frantoio durante il processo di rettifica.
Posizionare una fiala di rettifica nella camera di rettifica del mulino congelatore e bloccare in posizione. Chiudere il coperchio del frantoio e macinare il campione per tre cicli a due minuti per ciclo, ad una velocità di frantumazione di 14. Dopo che i cicli di macinazione sono stati completati sbloccare il flaconcino con il llysato a polvere congelata.
Per evitare che il lisato si scongeli, lavorare rapidamente e con attenzione per svitare una delle spine finali utilizzando lo strumento di apertura. Una volta aperta la fiala, rimuovere la barra del riflettore e trasferire rapidamente l'estratto di polvere congelata su un piatto di pesatura in plastica pre refrigerata. Recuperare il più possibile l'estratto congelato sbattendo la fiala sul breadboard di legno.
Una volta rimossa tutta la polvere dal flaconcino, trasferire rapidamente tutti gli estratti di polvere in un tubo pre-etichettato da 15 mil tenuto su ghiaccio secco. Sebbene sia meglio procedere immediatamente allo scongelamento e all'utilizzo degli estratti per ridurre al minimo la degradazione proteica, il lisato di polvere congelato può essere conservato durante la notte a meno 80, se necessario. Scongelare lentamente la polvere in un liquame di ghiaccio che viene continuamente diffuso utilizzando una barra di agitazione magnetica in un secchio di ghiaccio.
Per facilitare anche lo scongelamento, rimuovere frequentemente il ghiaccio che si sviluppa all'esterno dei tubi, circa ogni cinque minuti circa. Una volta che gli estratti iniziano a scongelarsi al cocktail inibitore della proteasi 1X e all'inibitore del proteasome micromolare MG132 per prevenire la degradazione delle proteine. Una volta che i campioni sono completamente scongelati, il che può richiedere più di un'ora, far girare i campioni a 3.220 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Questo giro rimuoverà la maggior parte dei detriti cellulari dal lisato. Quando lo spin è completo trasferire il supernatante in bottiglie di policarbonato che sono state prerimormate sul ghiaccio e scartare il pellet. Centrifuga il supernate e campiona a 16.000 G a quattro Gradi Celsius per 20 minuti per chiarire l'estratto.
Al termine dello spin, recuperare con attenzione solo il supernatante trasparente dal centro della colonna liquida senza disturbare lo strato torbido contenente il pezzo in cima o i detriti pelletati nella parte inferiore del tubo di centrifuga. Trasferire il litorato trasparente in un tubo fresco pre refrigerato da 15 Mil. Il liquido torboso rimanente può essere recente per cinque minuti alla stessa velocità per consentire il recupero di alcuni più del lysate all'ingrosso.
Gli estratti sono ora pronti per l'uso in esperimenti, come la purificazione di complessi proteici e l'immunoprecipitazione. Abbiamo confrontato due diversi metodi di lisi cellulare del lievito, vale a dire la fresatura di perline di vetro a quattro Gradi Celsius e un metodo automatizzato di macinazione criogenica a meno 196 Celsius per valutare le proteine relative recuperate e gli estratti cellulari preparati con entrambi i metodi. Da questo studio abbiamo scelto di utilizzare un ceppo di lievito in erba che trasporta un plasmide ad alta copia che esprime un tandem HIS-MYC taggato ubiquitina.
Quindi possiamo valutare l'affinità di recupero di proteine poliubiquitinate taggate da estratti all'ingrosso, a seguito della purificazione dell'affinità utilizzando talon cobalto HIS perline di affinità tag seguita da western blotting con un anticorpo monoclonale HIS tag. Le proteine poliubiquitinate che normalmente hanno vita molto breve a causa della loro rapida degradazione da parte dei macchinari proteasome di ubiquitina e quindi offrono un ottimo modo per confrontare la qualità degli estratti all'ingrosso preparati con diversi metodi. Come vediamo dalla metà destra della membrana macchiata di Ponceau, abbiamo recuperato una maggiore resa proteica totale negli estratti all'ingrosso preparati dal protocollo del mulino a crio congelatore come giudicato dalla colorazione Ponceau più intensiva in tutta la corsia di estrazione all'ingrosso.
Ciò è particolarmente evidente nelle parti inferiore e superiore delle corsie intere del frantoio. Inoltre, come mostrato dalla metà destra del tag HIS Western blot, abbiamo osservato un migliore recupero della proteina ubiquitinata del tag HIS-MYC seguita da pull down utilizzando perline Talon dagli estratti all'ingrosso preparati dalla macinazione criogenica. Concludiamo che il congelatore criogenico è superiore ad altri metodi per la preparazione degli estratti cellulari, specialmente quando sono necessarie macromolecole funzionali per l'applicazione a valle.
