Name: neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31501099) e dalla Mezza età e Dai Giovani del Dipartimento dell'Istruzione della Provincia di Hubei, Cina (n. trimestre 20191104). E ringraziamo il professor Wensheng Deng alla Wuhan University of Science and Technology per aver fornito le linee di cellule staminali embrionali del topo A2lox.

1. Coltura delle cellule staminali embrionali del topo
<ol><li>Preparare piatti o piatti di coltura cellulare ricoperti di gelatina 0,1%.<ol>
<li>Aggiungere 2 mL di gelatina sterilizzata allo 0,1% (0,1% w/v in acqua) a piatti di coltura cellulare da 60 mm. Dondolare delicatamente per garantire un rivestimento uniforme delle stoviglie di coltura cellulare.</li>
		<li>Mettere i piatti in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e lasciare il rivestimento per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0,1% prima di seminare le cellule. NOTA: Dopo aver rimosso la gelatina, non è necessario asciugare o lavare i piatti rivestiti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltura delle cellule staminali embrionali del topo (A2lox e 129)<ol>
<li>Incubare le cellule mESC (A2lox e 129) nell'incubatore di coltura cellulare 0,1% rivestito di gelatina da 60 mm in un mezzo di crescita mESC rispettivamente a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%. Il mezzo di crescita mESC è costituito per l'85% da DMEM/F12, per il 15% da sostituti del siero knock-out (KSR), per 0,1 mM β-mercaptoetanolo (2ME), 2 mM glutaMAX, 1% amminoacido non essenziale (NEAA), 1% penicillina/streptomicina (P/S), 1000 U/mL fattore inibitorio della leucemia (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibitore GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibitore MEK). ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è infiammabile e presenta tossicità per inalazione. Tenere lontano dalle fonti di fuoco e indossare una maschera per evitare l'inalazione durante l'uso.</li>
		<li>Cambia quotidianamente il mezzo di crescita mESC per una migliore crescita di A2lox e 129.</li>
		<li>Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL dello 0,1% di tripside al piatto. Dondolare delicatamente per 30 s per garantire una copertura uniforme della tripside su tutte le cellule.</li>
		<li>Lasciare le celle per circa 1 minuto per tripinaree quindi rimuovere la tripina utilizzando pipetta da 1 mL.</li>
		<li>Aggiungere più volte 2 mL di mezzo di crescita mESC al piatto, pipetta su e giù più volte per effettuare una sospensione a cella singola.</li>
		<li>Contare la densità delle cellule nella sospensione nel modo più accurato possibile usando l'emocitometro.</li>
		<li>Dividere le celle in 7 gruppi e indurre la differenziazione utilizzando protocolli diversi indicati nella tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Differenziazione dai MESC ai PNG (fase I)
<ol><li>Preparare 0,1% piatti di coltura cellulare rivestiti di gelatina o coverlips.<ol>
<li>Prima dell'uso, preparare 0,1% di gelatina rivestita con 6 piastre o coverlips come nel passaggio 1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 1(tabella 1)<ol>
<li>Seme circa 2 x 104 mESC in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo nelle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Controllare la densità cellulare al microscopio.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5% per 6 ore per consentire l'attacco.</li>
		<li>Dopo l'attacco, eserti dalle cellule dall'incubatrice e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I (Tabella 1) a ciascun pozzo e rimettere le cellule nell'incubatrice.</li>
		<li>Lasciare le cellule per la differenziazione per 8 giorni. Sostituire il mezzo di differenziazione basale I ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 2(tabella 1)<ol>
<li>Aggiungere 1,5 x 106 mESC in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I per consentire la formazione del corpo embrionale a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.</li>
		<li>Dopo 2 giorni, trasferire gli aggregati cellulari in tubi di centrifuga da 15 ml e lasciarli depositare per gravità.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione basale fresco I per risospendire i corpi embrioidi. Ripiantarli in un nuovo piatto batterico non adeso e consentire la differenziazione per altri 2 giorni.</li>
		<li>Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio (Figura 2A).</li>
		<li>Raccogliere corpi embrio embrioni come descritto nei passaggi 2.3.2-2.3.3. Semina circa 50 corpi embriobi in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo su piastre a 6 porci ricoperte di gelatina allo 0,1%.</li>
		<li>Preparare 1 mM di materiale RA tutto trans (in DMSO) e conservare lontano dalla luce in un congelatore a -80 °C dopo il sub-imballaggio. NOTA: RA è instabile e si dovrebbe prestare attenzione a tenerlo lontano dalla luce e ridurre il contatto con l'aria durante la preparazione del materiale RA.</li>
		<li>Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM.</li>
		<li>Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e differenziare per altri 4 giorni.</li>
		<li>Cambiare l'intero mezzo di differenziazione basale I (con 1 μM RA) ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 3(tabella 1)<ol>
<li>Piantare 1,5 x 106 mESC in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I. Lasciare per 2 giorni per la formazione del corpo embrionale a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.</li>
		<li>Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio (Figura 2B).</li>
		<li>Trasferire gli aggregati cellulari in tubi di centrifuga da 15 ml e lasciarli depositare per gravità.</li>
		<li>Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione basale fresco I per risospendirli.</li>
		<li>Seminare circa 50 corpi embrioidi in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo su piastre a 6 porci ricoperte di gelatina allo 0,1%.</li>
		<li>Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM.</li>
		<li>Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e differenziare per altri 6 giorni. Cambiare l'intero mezzo di differenziazione basale I (con 1 μM RA) ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 4(tabella 1)<ol>
<li>Seme circa 2 x 104 mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.</li>
		<li>Dopo l'attacco, lavare le celle due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 4 giorni nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C.</li>
		<li>Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA completamente trans in ogni pozzo (la concentrazione di lavoro è di 1 μM) per indurre la differenziazione per altri 4 giorni.</li>
		<li>Nell'intero processo, sostituire l'intero mezzo ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 5(tabella 1)<ol>
<li>Seme circa 2 x 104 mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 2 giorni nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C.</li>
		<li>Per la successiva induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 del 5% a 37 °C per indurre la differenziazione per altri 6 giorni.</li>
		<li>Nell'intero processo, sostituire l'intero mezzo ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 6(tabella 1)<ol>
<li>Piantare 1,5 x 106 mESC in una piastra batterica non adesiva in 10 mL di N2B27 medium II(tabella 1)per consentire la formazione di corpi embrioidi.</li>
		<li>Il 2° giorno, raccogliere gli aggregati cellulari come descritto nei passaggi 2.3.2-2.3.3 e resuspend i corpi embrioidi utilizzando 10 mL di N2B27 medio II fresco.</li>
		<li>Ripiantarli in un nuovo piatto batterico non adeso e consentire la differenziazione per altri 2 giorni nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio.</li>
		<li>Il 4,raccogliere corpi embrionale. Semina circa 50 corpi embriombrioidi per pozzo su piatti a 6 po 'rivestiti di gelatina 0,1% con 2 mL di N2B27 medium II.</li>
		<li>Aggiungere 2 μL di materiale RA completamente trans in ogni pozzo e indurre la differenziazione per altri 4 giorni. Sostituire l'intero mezzo (N2B27 medium II con 1 μM RA) ogni due giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 7(tabella 1)<ol>
<li>Seme circa 2 x 104 mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.</li>
		<li>Lavare le celle due volte con PBS. Quindi, aggiungere 2 mL di N2B27 medium II ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 8 giorni a 37 °C in un incubatore di CO2 al 5%.</li>
		<li>Cambiare l'intero N2B27 medium II ogni 2 giorni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Osservazione della morfologia cellulare
<ol><li>Controllare lo stato di differenziazione dei suddetti 7 gruppi al giorno sotto un microscopio a contrasto di fase invertito.</li>
	<li>Seleziona casualmente almeno 12 campi e scatta foto per registrare i cambiamenti morfologici di ogni gruppo su D8.</li>
</ol>4. Colorazione immunofluorescenza
<ol><li>Preparazione del campione: Semi mESC su coverlips rivestiti di gelatina allo 0,1% e consentire la differenziazione per 8 giorni utilizzando i protocolli menzionati nella fase 2.</li>
	<li>Risciacquo: L'8 ° giorno, prelevare i campioni dall'incubatore e rimuovere il mezzo di differenziazione per aspirazione. Risciacquare delicatamente le cellule una volta con 1 mL di PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Fissazione: Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% a ciascun campione e fissare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Risciacquo: Dopo la fissazione, sciacquare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS 3 volte, per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Permeabilizzazione: Aggiungere 1 mL dello 0,2% di TritonX-100 in PBS a ciascun campione e lasciare per 8 minuti a RT.</li>
	<li>Risciacquo: Dopo la permeabilità, sciacquare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS 3 volte, per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Blocco: Aggiungere 1 mL di siero di capra al 10% in PBS a ciascun campione e incubare a RT per 1 h per bloccare eventuali interazioni non specifiche.</li>
	<li>Incubazione con anticorpo primario<ol>
<li>Diluire l'anticorpo anti-nestina con un rapporto di 1:100 usando il 5% di siero di capra in PBS.</li>
		<li>Applicare 500 μL di anticorpi diluiti su diversi campioni e incubare durante la notte a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risciacquare: Rimuovere l'anticorpo e risciacquare delicatamente i campioni con 1 mL di PBS 3 volte per 8 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubazione con anticorpo secondario<ol>
<li>Diluire l'IgG anti-topo di capra etichettato Alexa Fluor 488 con un rapporto di 1:500 usando il 5% di siero di capra in PBS.</li>
		<li>Applicare 500 μL di anticorpo diluito su diversi campioni e incubare al buio per 2 ore a RT. NOTA: Dopo aver applicato anticorpi secondari fluorescenti, eseguire tutti i passaggi successivi al buio per evitare la tempra a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risciacquare: Rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare delicatamente i campioni con 1 mL di PBS 3 volte per 8 minuti ciascuno.</li>
	<li>Colorazione e montaggio nucleare<ol>
<li>Posizionare una goccia di supporto di montaggio DAPI sul microslide pulito.</li>
		<li>Eslevare con cura i campioni dalle piastre e posizionare il campione sopra il supporto di montaggio DAPI con la cella a faccia in giù. Lasciare al buio per 5 minuti a RT.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di montaggio DAPI in eccesso con carta assorbente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Osservazione della microscopia a fluorescenza<ol>
<li>Posizionare i campioni sotto la microscopia a fluorescenza e rilevare il segnale per DAPI e Alexa Fluor 488 utilizzando filtri adeguati.</li>
		<li>Scegli in modo uniforme e casuale 10-15 campi visivi diversi per ogni campione e registra le immagini con una fotocamera CCD.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Differenziazione dai PNG ai neuroni (Fase II)
<ol><li>Preparare i derivati mESC nell'ambito della differenziazione di fase I utilizzando il protocollo 3 (8giorni, tabella 1 ) come descritto nella fase 2.4, che ha la massima efficienza di differenziazione (cfr. figura 3). NOTA: Dopo la differenziazione della fase I, il controllo di qualità deve essere effettuato utilizzando l'osservazione della morfologia cellulare e il saggio di immunofluorescenza sopra menzionato, per garantire un NPC sano e ad alto rendimento.</li>
	<li>Seme circa 5 x 105 derivati mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 porci rivestite con gelatina allo 0,1%. Dividi casualmente le derivate mESC in 3 gruppi, rispettivamente come protocollo di fase II 1, protocollo 2 e protocollo 3.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore. Lavarli due volte con 2 mL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I, N2B27 medio I e N2B27 medio II (tabella 2), rispettivamente, a ciascun pozzo dei gruppi di cui sopra.</li>
	<li>Posizionare le piastre nell'incubatore e lasciare differenziare per altri 10 giorni. Cambiare il mezzo corrispondente ogni 2 giorni.</li>
	<li>Controllare lo stato di differenziazione e registrare i cambiamenti morfologici come menzionato nel passaggio 3.</li>
	<li>Il giorno 18, valutare la generazione di neuroni (β-Tubulina III positivo) e determinare l'efficienza di differenziazione dei 3 protocolli utilizzando nel passaggio 4.</li>
</ol>

<ol>
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E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel presente studio, abbiamo stabilito un metodo semplice ed efficace per la differenziazione neuronale dagli mESC, con materiali a basso costo e facilmente ostruibili. In questo metodo, 2 giorni di formazione del corpo embrionale seguiti da 6 giorni di induzione ra possono promuovere efficacemente la differenziazione degli MESC in NPC (protocollo di fase I 3). Per la differenziazione di fase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induce più efficacemente la differenziazione dai PNG ai neuroni. Per garantire il succe...

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono pluripotenti e possono differenziarsi in cellule precursori neurali (NPC) e successivamente in neuroni in determinate condizioni1. La neurogenesi basata su ESC fornisce la migliore piattaforma per imitare la neurogenesi, fungendo così da strumento utile per gli studi di biologia dello sviluppo e potenzialmente aiutare nella medicinarigenerativa 2,3. Negli ultimi decenni, sono state riportate molte strategie per indurre la neurogenesi embrionale, come il metodo transgenico4, utilizzandopiccolemolecole 5,utilizzando un microambiente a matrice 3D6e la tecnica di co-coltura7. Tuttavia, la maggior parte di questi protocolli sono condizioni limitate o difficili da usare, quindi non sono adatti per l'uso nella maggior parte dei laboratori.
Per trovare un metodo facile da usare e a basso costo per ottenere un'efficiente differenziazione neurale dagli MESC, qui è stata utilizzata una strategia di screening combinatorio. Come descritto nella figura 1, l'intero processo di neurogenesi embrionale è stato diviso in 2 fasi. La fase I si riferisce al processo di differenziazione dagli mESC ai PNG, e la fase II si riferisce alla successiva differenziazione dai PNG ai neuroni. Sulla base dei principi di facile funzionamento, basso costo, materiali facilmente disponibili e alta efficienza di differenziazione, sono stati scelti sette protocolli nella fase I e tre protocolli nella fase II in base al tradizionale sistema di coltura monostrato aderente o al sistema di formazione del corpo embrionale8,9. L'efficienza di differenziazione dei protocolli in entrambe le fasi è stata valutata utilizzando l'osservazione della morfologia cellulare e il test di immunofluorescenza. Combinando il protocollo più efficiente di ogni fase, abbiamo stabilito il metodo ottimizzato per la differenziazione neurale dagli mESC.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, and protect from light</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>stored at room temperature</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor human</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nonadhesive bacterial dish</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>stored at -80 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Maintained in feeder-free culture system</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 - well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

La differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali del topo (mESC) è un potenziale strumento per chiarire i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi e potenzialmente aiutare nella medicina rigenerativa. Qui, abbiamo stabilito un metodo efficiente e a basso costo per la differenziazione neuronale dagli mESC invitro, utilizzando la strategia dello screening combinatorio. Nelle condizioni qui definite, la formazione del corpo embrionale di 2 giorni + il protocollo di induzione dell'acido retinoico di 6 giorni consente una differenziazione rapida ed efficiente dagli MESC alle cellule precursori neurali (NPC), come visto dalla formazione di derivati A2lox e 129 ben impilati e simili a neurite che sono positivi alla Nestin. Lo stato sano dei corpi embrioidi e il momento in cui viene applicato l'acido retinoico (RA), così come le concentrazioni di RA, sono fondamentali nel processo. Nella successiva differenziazione dai NPC ai neuroni, N2B27 medium II (integrato da mezzo neurobasale) potrebbe supportare meglio il mantenimento e la maturazione a lungo termine delle cellule neuronali. Il metodo presentato è altamente efficienza, a basso costo e facile da usare e può essere un potente strumento per la neurobiologia e la ricerca sulla biologia dello sviluppo.

La formazione del corpo embrionale di 2 giorni + l'induzione ra di 6 giorni funziona meglio per dirigere la differenziazione degli MESC in NPC (Fase I). Per determinare il protocollo ottimale che promuove meglio la differenziazione degli MESC in NPC (fase I), sono stati testati 7 protocolli sia su A2lox che su 129 mESC(tabella 1)e lo stato di differenziazione di ciascun gruppo è stato monitorato utilizzando il microscopio a luce. Come mostrato nella figura 3A, la maggior pa...

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Video: Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Valutazione funzionale di neurotossine biologiche in Culture in rete di cellule staminali derivate dal Sistema Nervoso Centrale Neuroni

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Neuroscienze

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologia

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Una tecnica per generare cellule progenitrici neurali da cellule staminali embrionali di topo

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.